3eacuteme anneacutee PARASITOLOGIE

Techniques drsquoeacutetude en parasitologie

Dr BENTAHAR Assia

Deacutepartement de Biologie et Physiologie Animale

Universiteacute Ferhat Abbas Seacutetif 1

Faculteacute des Sciences de la Nature et de la Vie

TECHNIQUES DrsquoEacuteTUDE EN PARASITOLOGIE

OBJECTIF

Agrave connaitre les diffeacuterentes meacutethodes de recherches

des parasites selon

leurs groupes et leur localisation

-Protozoires

-Helminthes

-Arthropodes

-P intestinaux

-P sanguins

-P urinaires

Maladie parasitaire

-Historique

-Le parasite biologie

-Reacutepartition geacuteographique

-Description clinique

-Pathogeacutenie

-Deacutefense de lrsquoorganisme

-Diagnostic

biologique -Theacuterapeutique

-Prophylaxie

Modes de parasitisme

Localisation

Classification

Cycle eacutevolutif

-D drsquoorientation clinique

-D direct ou parasitologique

-D indirect ou immunologique

DIAGNOSTIC DIRECTE

PRELEVEMENT

PREPARATION

LrsquoEXAMEN

Selle urine sang

vaginaux ureacutetraux

Cutaneacutes autres

Cleacutes de deacutetermination

des œufs et larves

Chaque parasite nrsquoest

bien mis en eacutevidence

que par la technique qui

lui est adapteacute

Un examen neacutegatif isoleacute nrsquoa aucune valeur drsquoeacutelimination

Seacutecuriteacute au laboratoire (principes geacuteneacuteraux)

-un manuel des consignes de seacutecuriteacute au

laboratoire

-trousse de secours

-vecirctements protecteurs

-nettoyer les paillasses (deacutetergent et

deacutesinfectent les surfaces)

-se laver les mains

-manipulation des preacutelegravevements exige des

preacutecautions particuliegraveres surtouts en cas des

preacutelegravevement de sang (potentiellement

infectieux)

-eacutelimination des lames porte-objets

Entretien du microscope

Ce que vous devez faire

Etalonnage du microscope

taille est un critegravere important

(kyste et œufs)

cellule heacutematimegravetrique

un micromegravetre oculaire

LA COPROLOGIE

PARASITAIRE

Chapitre 1 Premiegraveres observations des parasites

La coprologie parasitaire ou lrsquoexamen parasitologique des

selles EPS met en eacutevidence et identifie

Les parasites vivants dans le tube digestif Ex Protozoaires et

helminthes (Ascaris lumbricoides tronguiloides stercoralis)

Les parasites pour les quelles les selles sont un moyen drsquoeacutelimination de

leur forme de disseacutemination dans le milieu exteacuterieur Ex Schistosoma mansoni

(vit dans le plexus veineux)

LrsquoEPS mettra en eacutevidence

- une partie du parasite Ex Anneaux deTaenia saginata qui se deacutetachent en

dehors des selles

- une forme eacutevolutive du parasite (larve et oeuf drsquohelminthe) Ex oeuf

drsquoAncylostoma duodenalis

- la forme deacutefinitive du parasite Ex adulte drsquohelminthe Strongyloides stercoralis

les formes veacutegeacutetatives des amibes et des flagelleacutes sont

fragiles dans le milieu exteacuterieur

Preacuteparation du malade

Reacutegime alimentaire limiteacute avant de faire lrsquoexamen Eacuteviter de consommer Les fruits agrave cuticule dure (poires

pommes) Feacuteculents et graines agrave enveloppes segraveches

(lentillefegraveves) Foie drsquoovins ou de bovins

Arrecircter des meacutedicaments - Les antiseptiques intestinaux

- Les antibiotiques et les sulfamides

- Les laxatifs tels que le bismuth le charbon lhuile de paraffine

les suppositoires

--Ne pas faire de radiologie digestive utilisant des produits de

contraste comme la baryte

Fiche clinique

acircge sexe adresse animaux de compagnie profession

(veacuteteacuterinaire agriculteur) habitudes alimentaires statut

immunitaire

PRELEVEMENT

Nombre de preacutelegravevements

Une seul analyse ne permet de deacuteceler la preacutesense

drsquoeacuteleacutements parasitaires que dans 30 des cas

- Rareteacute des eacuteleacutements parasitaires

- Efficaciteacute des techniques utiliseacutees

-Une peacuteriode muette de rejet des eacutelements

caracteacuteristiques (giardiase amibiase)

Il faut dans lrsquoideal pratiquer trois

examens coprologiques agrave quelques

jours drsquointervalle pour affirmer la

neacutegativiteacute

Recueil des selles

-Reacutecipient propre et sec agrave bouchage hermeacutetique

-faire recueillir lrsquoensemble de lrsquoeacutemission

-etiquetage prescripteur nom du patient date

du preacutelegravevement et traitement observeacute si il existe

- les selles ne doit surtout pas ecirctre meacutelanger aux

urines (destruction des formes veacutegeacutetatives)

Deacutelai drsquoexamen

Il faut que la selle parvienne dans les plus brefs deacutelais au

laboratoire afin drsquoeacuteviter la deacutegeacuteneacuterescence des formes

veacutegeacutetatives des protozoaires qui sont sensible agrave la variation

de tempeacuteratures et agrave la deacuteshydratation

Techniques de conservation

Conservation provisoire par le froid (+4degC)

-Bonne conservation des kystes de protozoaires etou

œufs drsquohelminthes

-Mort rapide des trophozoites de protozoaire

-Mort les larves drsquoanguilules

Meacutethode agrave lrsquoeau formoleacutee ( fixation conservation)

-Aldehyde formique( formol) de 5 agrave 20

-Glyceacuterine( facultatif)

-Eau distilleacutee ou lrsquoeau physiologique 100ml La selle +

3 vol 1 vol

tamiser Sedimenter stoker

Bonne conservation œufs drsquohelminthe et kystes de

protozoaires tant que le preacutelegravevement reste liquide

Fixation au MIF (Merthiolate-Iode-Formol)

SOLUTION 1 de mercurothiolate iode

ndashformol

-teinture de mercurethiolate 200 ml

-glycerine 5 ml

-formol agrave 40 25 ml

-eau distilleacutee 250 ml

SOLUTION 2 de Lugol

-iode 05 g

-iode de potassium 1g

-eau distilleacutee 10 ml

1175 ml 075ml +

3 agrave 5 g selles

Triturer stoker

Conservation beaucoups plus longue des

formes veacutegeacutetatives et les kystes de protozoaires

Meacutelange fixateur agrave lrsquoalcool polyvinylique APV

APV

-alcool polyvinylique en poudre

5g

-glyceacuterol 15ml

-eau distilleacutee 625 ml

un bain marie ( 70 -75degC)10mn

Fixateur de Schaudinn modifieacute

-cristaux de clorure de mercure HgCl2

15g

-ethanol agrave 95 31 ml

Acide aceacutetique glacial 5ml +

2 agrave 3 mn

-Bonne conservation

-Une fixtion permettant de pratiquer des

frottis pouvant etre coloreacutes

Concervation des vers

Neacutematotes

Treacutematodes

cestodes

+ eau physiologique Entre 2 lames

Plongeacutes dan un fixteur

Ex - alcool 70 bouillant

- meacutelange alcool et formol

Aspect normal de la selle - poids de 110 agrave 150 g

- couleur brune

- Une consistance ferme et un aspect mouleacute

-- Un pH drsquoenviron 7

Microscopiquement en doit observeacute

-- Des fibres musculaires

-- De la cellulose non digestible poils vaisseaux

ligneux eacuteleacutements scleacutereux

-- de lrsquoamidon si le reacutegime est riche en feacuteculents et chez

lrsquoenfant

-- Quelques masses amorphes ou disques radieacutes ( les

savons)

-- il ne doit pas avoir de globules gras ( graisses

neutres)

COPROLOGIE PARASITAIRE Conduite de lrsquoexamen

1048766 Examen macroscopique

1048766 Examen microscopique

- Examen direct sans concentration

- Examen direct apreacutes concentration

- Les meacutethodes physiques

- Techniques de flottation

- Techniques de seacutedimentation

- Les meacutethodes physico-chimiques

- Les meacutethodes combineacutees

-Colorations speacutecifiques

- cultures

- Examens particuliers

Lrsquoobservation macroscopique Il permet de noter

- Couleur ( brune jaune ou ocre verte

deacutecoloreacutee noire rouge)

- consistance (molle dure liquide)

- aspect (preacutesence de bulles ou de gras

steacuteatorrheacutee)

- Preacutesence drsquoeacuteleacutements surajouteacutes

-Parasites adulte drsquoAscaris femelle drsquooxuyre

anneau ou chaine de taenia

-glaire (mucus)

-sang de pus

Lrsquoexamen direct sans concentration -Lexamen direct est le seule examen qui permet drsquoappreacutecier la vitaliteacute des

parasites

-Il met en eacutevidence les kystes et les formes veacutegeacutetatives de protozoaires ainsi

quelques oeufs et les larves dhelminthes

- On peut rajouter du Lugol double sur la lame qui fixe et colore les

structure nucleacuteaires

- Quelque soit le reacutesultat de lrsquoexamen direct on doit obligatoirement le

compleacuteter par deux techniques de concentration lrsquoune pour les kystes et

lrsquoautre pour les oeufs

- Il est impeacuteratif de connaitre la deacutescription des eacuteleacutements parasitaire et

de retenir les possibles faux parasites

Lrsquoobservation microscopique

une noisette de selle

(agrave diffeacuterents endroits)

lrsquoeau physiologique

agrave 09

suspension homogegravene

2 gouttes sur une

lame recouvrir par

une lamelle

lecture en

zig-zag x10

x 40

+

Les meacutethodes de concentrations

Les techniques par lesquelles on

essaie agrave partir de la grande quantiteacute

de la matieres feacutecales recueillies

drsquoobtenir dans un faible volume les

œufs larves kystes voire formes

veacutegeacutetatifs fixeacutees de parasites par

eacutelimination des reacutesidus de la

digestion

Les meacutethodes physiques

Les selles dilueacutees dans un reacuteactif de densiteacute

diffeacuterente de celle de parasite

DR superieur DP = flottation

DR inferieur DP = seacutedimentation

A-Techniques de flottation

Crsquoest une technique part du principe que la densiteacute du liquide et supeacuterieur

agrave celle des parasites ces derniers plus leacutegers flottent agrave la surface

Les principales techniques de flottation

- Meacutethode de Fullborn (1920) elle utilise une solution satureacutee de NaCl

(NaCl 250g ED 750ml d=12)

- Meacutethode de Willis (1921) simple et utilisable en routine

bullDiluer une noisette de selle dans la solution satureacutee de NaCl agrave 25

bullRemplissez un tube en verre conique jusquagrave sonbord en formant un

meacutenisque concave (verre de montre) sur lequel on deacutepose une lamelle

pendant 15 minutes (pas plus pour eacuteviter la cristalisation des oeufs) On la

deacutepose ensuite sur une lame porte objet et on observe agrave lrsquoobjectif X10 agrave la

recherche des OEufs drsquohelminthes tels que ceux drsquoHymenolepis ou

drsquoAnkylstomes

-Meacutethode de Janeckso et Urbanyi(1931) utilise comme reacuteactif une

solution de domercurate de potassium ( d=114) qui doit etre manipuleacutee

avec prudence

Iodo-mercurate de potassium

Bi iodure de mercure 100g

Iodure de potassium 74g

Eau distilleacutee 50 ml

-Meacutethode de Faust (1938) on centrifuge agrave 1500 tm une dilution des

selles dans lrsquoeau ordinaire tieacutede et on rejette le surnageant et on remet le

culot en suspension dans drsquoeau On reacutepegravete lrsquoopeacuteration jusqursquoagrave ce que le

surnageant soit limpide on remet alors le culot en suspension dans le

sulfate de Zink agrave 33 Apreacutes centrifugation on preacutelegraveve agrave lrsquoanse de

platine la pellicule de surfase qursquoon examine au microscope

- Meacutethode drsquoOtto Hwitt et Straham (1941) on procegravede de la meme

maniere que pour le Willis mais avec une solution aqueuse de sulfate

de Zink agrave 33 D=118

Avantage -Technique simple

-Mateacuteriel rudimentaire

- reacutealisation en seacuterie

-Sensibiliteacute treacutes bonne++++

Inconveacutenient

-Elle a ce pendant lrsquoinconveacutenient drsquoalteacuterer des Larves et les

Kystes pour les quels elle est contre-indiqueacutee ( reactifs

hypertoniques) de mecircme que pour les selles liquides ou

riches en lipides

-Elle donne de bons reacutesultats pour les oeufs drsquohelminthes

leacutegers (oeufs drsquoHymenolepis drsquoAnkylostome et deTaelignia)

B-Techniques de seacutedimentation bullLe diluant a une densiteacute inferieure agrave celle du

parasite alors se dernier se seacutedimente

Les principales techniques

- Meacutethode par seacutedimentation simple

- Meacutethode de Faust et IngallsReacutealiseacutee en utilisant

lrsquoeau glyceacuterineacutee (Eau + Glyceacuterine agrave 05) elle

permet drsquoaugmenter la mouillabiliteacute qui facilite la

seacutedimentation des parasites larves Anguillules

Œufs drsquoAscaris non feacutecondeacutes et œufs de

Schistosoma mansoni

-Meacutethode de Baroody et MostSeacutedimentation

centrifugation Eau de robinet chauffeacutee agrave 42degC

- Meacutethode de Jahnes et Hodges

Avantage -Technique simple

-Mateacuteriel rudimentaire

- reacutealisation en seacuterie

- Traitent une grande masse feacutecale ( parasites rares ou irreacuteguliegraverere ment

repartis dans la selle)

Inconveacutenient -une technique longue agrave reacutealiser

-Les cellules veacutegeacutetales seacutedimentent aussi vite que les parasites (Preacutesence

de certains reacutesidus)

-Non indiqueacutes en routine (sensibiliteacute

moyenne++)

Meacutethodes physico-chimiques ou

Diphasiques Caracteacuteriseacutees par la mise en preacutesence de deux

phases non miscibles lrsquoune aqueuse et lrsquoautre

constitueacutee par lrsquoeacutether qui est un solvant des lipidesil

se creacutee un coefficient de partage entre ces deux

phases et la reacutepartition de chaque eacuteleacutement feacutecal dans

chacune drsquoelles sera isoleacutes en fonction de son pouvoir

hydrophile ou lipophile

Bailenger a montreacute que le pH de la solution eacutetait

leacuteleacutement deacuteterminant pour la plus ou moins grande

efficaciteacute dune technique selon le parasite rechercheacute

Principes theacuteoriques

-Les selles tritureacutees (meacutelange au dixiegraveme environ) dans la solution choisie - elle peut ecirctre preacutealablement passeacutee sur un tamis pour eacuteliminer les gros deacutebris

le filtrat est verseacute dans un tube agrave centrifuger agrave fond conique en le remplissant 13

deacutether de maniegravere agrave ce quil y ai 23 du meacutelange selle en laissant 1 cm pour

fermer le tube

- Lrsquoagiter pendant une minute

- La suspension eacutetheacutero-liquide obtenue est centrifugeacutee agrave une vitesse lente de

lordre de 1500 agrave 2000 toursminute pendant une agrave trois minutes

- Apregraves centrifugation les constituants de la suspension sont reacutepartis en quatre

Couches

- Deacutecoller la couche des reacutesidus lipophiles agrave laide dune baguette de verre

- Retourner le tube au dessus de leacutevier (en faisant couler de leau) ou dun bac agrave

deacutechets liquides

- Essuyer les parois du tube avec un coton tenu agrave la pince en laissant toujours le

tube avec louverture dirigeacutee vers le bas pour eacuteviter de souiller le culot avec les

reacutesidus

- Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique pour

remettre en suspension le culot qui sera examineacute

- le culot qui nous inteacuteresse qui contient les eacuteleacutement parasitaires (kystes des

protozoaires)

Ether Debris

Phase aqueuse

Le culot

Les meacutethodes diphasiques sont

-Meacutethode de Telmann 1908

-Meacutethode De Rivas 1928

-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917

-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946

-Meacutethode De Ritchie 1948

-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood

-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf

-Meacutethode De Roman 1957

-Meacutethode de Bailenger 1962-1963

-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle

-Meacutethode de Junod 1927

Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage

Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia

Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)

La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble

lors de la centrifugation ce qui est un argument

diagnostique inteacuteressant

- Inconveacutenients

Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve

restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave

deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses

- Deacuteroulement de la technique

acide aceacutetique cristallisable 5 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethode de Bailenger - Avantages

Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et

des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5

(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)

- Inconveacutenients

Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre

technique est neacutecessaire

- Deacuteroulement de la technique

aceacutetate de sodium 15 g

acide aceacutetique 36 ml

eau distilleacutee qsp 1000 ml

Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide

dun pH-megravetre

Meacutethode de Ritchie simplifieacutee

- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles

formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour

enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les

oeufs dascaris et de schistosome

- Inconveacutenients

Le culot souvent volumineux est de lecture difficile

- Deacuteroulement de la technique

- Solutions de Ritchie

eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt

eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)

Meacutethode de Blagg et al

-Avantages

-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire

les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de

liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de

mercure souille les effluents du laboratoire

- Deacuteroulement de la technique

Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou

additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est

verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation

eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes

Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)

permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute

Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et

recommencer lagitation

On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et

cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee

Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages

-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles

Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes

aiseacutement et facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de

schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue

que les techniques en un temps

- Deacuteroulement de la technique

A) NaCl 9 g

formol officinal 10 ml

eau qsp 1000 ml

B) acide citrique 100 g

formol officinal 20 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethodes combineacutees

Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et

par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande

quantiteacute de selles

Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les

rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des

formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale

- Inconveacutenients

Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez

mal - Deacuteroulement de la technique

A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml

formol officinal 100 ml

eau qsp 1 000 ml

B bromure de sodium cristalliseacute 622 g

eau distilleacutee 1000 ml

Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant

pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou

kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour

trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente

- Inconveacutenients

Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps

assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate

preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)

- Deacuteroulement de la technique

- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)

liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml

eau distilleacutee 334 ml

Concentration diphasique

(MIF ou Bailenger)

une solution de

sulfate de zinc

30 secondes agrave f v

dilueacute au quart avec ED

Examiner

Le culot

Examiner

Le culot

iodomercurate

de potassium

de densiteacute 15

dilueacute au quart avec ED

Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod

simplifieacutee) - Avantages

donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete

- Inconveacutenients

Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi

dune solution de iodomercurate

- Deacuteroulement de la technique

Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)

- aceacutetate de sodium 15 g

- acide aceacutetique cristallisable 20 ml

- formol 40 ml

-eau qsp 1000 ml

Solution B (densiteacute 140)

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 442 volumes

8 g de selles

50 ml de solution de NaCl agrave

85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min

Suspension homo

+Tamisage Examiner

Le culot

eacuteliminer

le surnageant

20 ml dune solution A

+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique

1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min

4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer

le surnageant

Examiner

Le culot

Meacutethode de seacutedimentation-flottation

pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves

- Inconveacutenients

Quand la teneur des selles en lipides est anormalement

eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de

graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique

Solution de densiteacute 135

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 520 volumes

la suspension feacutecale en

eau agrave 85 de NaCl

1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min

1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min

20 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacute

eacuteliminer

le surnageant

5 agrave 7 ml de solution diodomercurate

de potassium de densiteacute 135 20 ml deau

Examen du culot

Seacutedimentation-flottation au saccharose

pour protozoaires - Avantages

permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les

kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand

lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste

na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des

selles fixeacutees au MIF

- Inconveacutenients

Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et

flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De

plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre

que des sels de mercure sont encore utiliseacutes

-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose

saccharose 120 g

eau 200 ml

Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et

utiliser alors

saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml

Suspension homo

+Tamisage +

2 agrave 3 heures

50 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacutee

fraicircche

10 agrave 15 ml de la suspension

1800-2000 toursmin 90sec

rejeter le surnageant

L 1 en12humide

3 agrave 4 g de selles

Seacute

dim

en

tatio

n

8 agrave 10 ml de solution de saccharose

+ 05 ml de solution de chlorure

mercurique agrave 15 en ED

1000 toursmin 45 sec

deacutecanter le

surnageant

dans T2

L 2 en12humide

Flottation

T2 20 agrave 30 ml deau

2000 toursmin90 sec

L 3 en12humide

Preacutecipitation

Les colorations

utile en cas de doute lrsquoidentification des

kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces

des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires

coloreacutees

recommandeacutee pour la conservation de

mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre

laboratoire pour avis

indispensable pour le diagnostic de certains

parasites (Cryptosporides microsporides)

Meacutethodes de coloration rapides

(Colorations en tubes)

- Meacutethode de Bailenger et Faraggi

- Meacutethode de Sapro Lawless et

Strome

-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene

tamporeacute

-Meacutethode de Horkin

- Meacutethode de Sargeaut

-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero

Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de

Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-

formol Apregraves meacutelange

- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave

laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout

-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le

fond du tube

-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en

protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees

immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine

des noyaux est coloreacutee en brun par liode

Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent

donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol

sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement

leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes

- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou

directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension

de selles avec le colorant

Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des

protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux

apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs

jours

la coloration de Bailenger

Laisser pendant une nuit en contact

cristal violet 2 g

fuchsine basique 005 g

alcool agrave 95deg 20 ml

pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml

eau distilleacutee 100 ml

Coloration des frottis

Pour bien observer les structures nucleacuteaires et

garder des lames de reacutefeacuterence on

confectionne un frottis de selles humide et

eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en

- 3 temps fixation puis coloration puis

diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)

- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg

Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)

Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag

- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher

soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains

dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)

soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)

soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1

heure)

-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode

-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau

- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3

30 min agrave leacutetuve agrave 37deg

- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece

24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs

-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au

microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent

nettement

-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau

-Deacuteshydrater

-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est

poseacutee deacutefinitivement

- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les

trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure

des noyaux Les kystes apparaissent en bleu

pacircle avec des noyaux bien nets Cest une

technique facile agrave reacutealiser

- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible

- Plonger la lame dans le fixateur colorant de

Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures

- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au

baume de Canada ou au baume syntheacutetique

Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par

Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie

- Seacutechage

- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol

- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid

- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet

- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20

secondes en agitant

- Rinccedilage

-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5

- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100

- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert

Coloration des microscporidies

Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10

- Effectuer un frottis de la selle

- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de

meacutethanol

- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes

- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord

en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml

- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge

Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee

microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-

Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution

- Colorer pendant 3 heures

- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02

-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-

Rincer seacutecher et lire au grossissement x100

Coloration par Uvitex 2B

Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute

pour la chitine Met en eacutevidence les

microsporidie par une fluorescence

directe On obtient une

fluorescence bleue pale sur fond

noir

Scotch test anal ( test de Graham agrave

la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius

vermicularis ainsi que les anneaux ou les

oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors

de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est

appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant

toute toilette en position foetale ou genou

pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus

et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute

sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera

agrave lrsquoobjectif X10

NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les

parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que

la technique devra ecirctre faite avec des gants

ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite

pour eacuteviter la contamination par les oeufs

auto-infestant de lrsquooxyure

Meacutethodes speacuteciales

Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon

eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs

drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle

de la taille drsquoun petit pois

Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen

des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm

dans une quantiteacute de vert malachite agrave

3 (contre colorant) et de glyceacuterine

appliquer la bande sur la selle et sur la

lame renverser et appuyer sur la

paillasse

Methode de Kato-Katz quantitative

utilise un gabarie pour la selle

Meacutethode efficace pour la recherche

doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale

mais inutilisable pour les kytes et les

larves ainsi que les oeufs dankylostome

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

TECHNIQUES DrsquoEacuteTUDE EN PARASITOLOGIE

OBJECTIF

Agrave connaitre les diffeacuterentes meacutethodes de recherches

des parasites selon

leurs groupes et leur localisation

-Protozoires

-Helminthes

-Arthropodes

-P intestinaux

-P sanguins

-P urinaires

Maladie parasitaire

-Historique

-Le parasite biologie

-Reacutepartition geacuteographique

-Description clinique

-Pathogeacutenie

-Deacutefense de lrsquoorganisme

-Diagnostic

biologique -Theacuterapeutique

-Prophylaxie

Modes de parasitisme

Localisation

Classification

Cycle eacutevolutif

-D drsquoorientation clinique

-D direct ou parasitologique

-D indirect ou immunologique

DIAGNOSTIC DIRECTE

PRELEVEMENT

PREPARATION

LrsquoEXAMEN

Selle urine sang

vaginaux ureacutetraux

Cutaneacutes autres

Cleacutes de deacutetermination

des œufs et larves

Chaque parasite nrsquoest

bien mis en eacutevidence

que par la technique qui

lui est adapteacute

Un examen neacutegatif isoleacute nrsquoa aucune valeur drsquoeacutelimination

Seacutecuriteacute au laboratoire (principes geacuteneacuteraux)

-un manuel des consignes de seacutecuriteacute au

laboratoire

-trousse de secours

-vecirctements protecteurs

-nettoyer les paillasses (deacutetergent et

deacutesinfectent les surfaces)

-se laver les mains

-manipulation des preacutelegravevements exige des

preacutecautions particuliegraveres surtouts en cas des

preacutelegravevement de sang (potentiellement

infectieux)

-eacutelimination des lames porte-objets

Entretien du microscope

Ce que vous devez faire

Etalonnage du microscope

taille est un critegravere important

(kyste et œufs)

cellule heacutematimegravetrique

un micromegravetre oculaire

LA COPROLOGIE

PARASITAIRE

Chapitre 1 Premiegraveres observations des parasites

La coprologie parasitaire ou lrsquoexamen parasitologique des

selles EPS met en eacutevidence et identifie

Les parasites vivants dans le tube digestif Ex Protozoaires et

helminthes (Ascaris lumbricoides tronguiloides stercoralis)

Les parasites pour les quelles les selles sont un moyen drsquoeacutelimination de

leur forme de disseacutemination dans le milieu exteacuterieur Ex Schistosoma mansoni

(vit dans le plexus veineux)

LrsquoEPS mettra en eacutevidence

- une partie du parasite Ex Anneaux deTaenia saginata qui se deacutetachent en

dehors des selles

- une forme eacutevolutive du parasite (larve et oeuf drsquohelminthe) Ex oeuf

drsquoAncylostoma duodenalis

- la forme deacutefinitive du parasite Ex adulte drsquohelminthe Strongyloides stercoralis

les formes veacutegeacutetatives des amibes et des flagelleacutes sont

fragiles dans le milieu exteacuterieur

Preacuteparation du malade

Reacutegime alimentaire limiteacute avant de faire lrsquoexamen Eacuteviter de consommer Les fruits agrave cuticule dure (poires

pommes) Feacuteculents et graines agrave enveloppes segraveches

(lentillefegraveves) Foie drsquoovins ou de bovins

Arrecircter des meacutedicaments - Les antiseptiques intestinaux

- Les antibiotiques et les sulfamides

- Les laxatifs tels que le bismuth le charbon lhuile de paraffine

les suppositoires

--Ne pas faire de radiologie digestive utilisant des produits de

contraste comme la baryte

Fiche clinique

acircge sexe adresse animaux de compagnie profession

(veacuteteacuterinaire agriculteur) habitudes alimentaires statut

immunitaire

PRELEVEMENT

Nombre de preacutelegravevements

Une seul analyse ne permet de deacuteceler la preacutesense

drsquoeacuteleacutements parasitaires que dans 30 des cas

- Rareteacute des eacuteleacutements parasitaires

- Efficaciteacute des techniques utiliseacutees

-Une peacuteriode muette de rejet des eacutelements

caracteacuteristiques (giardiase amibiase)

Il faut dans lrsquoideal pratiquer trois

examens coprologiques agrave quelques

jours drsquointervalle pour affirmer la

neacutegativiteacute

Recueil des selles

-Reacutecipient propre et sec agrave bouchage hermeacutetique

-faire recueillir lrsquoensemble de lrsquoeacutemission

-etiquetage prescripteur nom du patient date

du preacutelegravevement et traitement observeacute si il existe

- les selles ne doit surtout pas ecirctre meacutelanger aux

urines (destruction des formes veacutegeacutetatives)

Deacutelai drsquoexamen

Il faut que la selle parvienne dans les plus brefs deacutelais au

laboratoire afin drsquoeacuteviter la deacutegeacuteneacuterescence des formes

veacutegeacutetatives des protozoaires qui sont sensible agrave la variation

de tempeacuteratures et agrave la deacuteshydratation

Techniques de conservation

Conservation provisoire par le froid (+4degC)

-Bonne conservation des kystes de protozoaires etou

œufs drsquohelminthes

-Mort rapide des trophozoites de protozoaire

-Mort les larves drsquoanguilules

Meacutethode agrave lrsquoeau formoleacutee ( fixation conservation)

-Aldehyde formique( formol) de 5 agrave 20

-Glyceacuterine( facultatif)

-Eau distilleacutee ou lrsquoeau physiologique 100ml La selle +

3 vol 1 vol

tamiser Sedimenter stoker

Bonne conservation œufs drsquohelminthe et kystes de

protozoaires tant que le preacutelegravevement reste liquide

Fixation au MIF (Merthiolate-Iode-Formol)

SOLUTION 1 de mercurothiolate iode

ndashformol

-teinture de mercurethiolate 200 ml

-glycerine 5 ml

-formol agrave 40 25 ml

-eau distilleacutee 250 ml

SOLUTION 2 de Lugol

-iode 05 g

-iode de potassium 1g

-eau distilleacutee 10 ml

1175 ml 075ml +

3 agrave 5 g selles

Triturer stoker

Conservation beaucoups plus longue des

formes veacutegeacutetatives et les kystes de protozoaires

Meacutelange fixateur agrave lrsquoalcool polyvinylique APV

APV

-alcool polyvinylique en poudre

5g

-glyceacuterol 15ml

-eau distilleacutee 625 ml

un bain marie ( 70 -75degC)10mn

Fixateur de Schaudinn modifieacute

-cristaux de clorure de mercure HgCl2

15g

-ethanol agrave 95 31 ml

Acide aceacutetique glacial 5ml +

2 agrave 3 mn

-Bonne conservation

-Une fixtion permettant de pratiquer des

frottis pouvant etre coloreacutes

Concervation des vers

Neacutematotes

Treacutematodes

cestodes

+ eau physiologique Entre 2 lames

Plongeacutes dan un fixteur

Ex - alcool 70 bouillant

- meacutelange alcool et formol

Aspect normal de la selle - poids de 110 agrave 150 g

- couleur brune

- Une consistance ferme et un aspect mouleacute

-- Un pH drsquoenviron 7

Microscopiquement en doit observeacute

-- Des fibres musculaires

-- De la cellulose non digestible poils vaisseaux

ligneux eacuteleacutements scleacutereux

-- de lrsquoamidon si le reacutegime est riche en feacuteculents et chez

lrsquoenfant

-- Quelques masses amorphes ou disques radieacutes ( les

savons)

-- il ne doit pas avoir de globules gras ( graisses

neutres)

COPROLOGIE PARASITAIRE Conduite de lrsquoexamen

1048766 Examen macroscopique

1048766 Examen microscopique

- Examen direct sans concentration

- Examen direct apreacutes concentration

- Les meacutethodes physiques

- Techniques de flottation

- Techniques de seacutedimentation

- Les meacutethodes physico-chimiques

- Les meacutethodes combineacutees

-Colorations speacutecifiques

- cultures

- Examens particuliers

Lrsquoobservation macroscopique Il permet de noter

- Couleur ( brune jaune ou ocre verte

deacutecoloreacutee noire rouge)

- consistance (molle dure liquide)

- aspect (preacutesence de bulles ou de gras

steacuteatorrheacutee)

- Preacutesence drsquoeacuteleacutements surajouteacutes

-Parasites adulte drsquoAscaris femelle drsquooxuyre

anneau ou chaine de taenia

-glaire (mucus)

-sang de pus

Lrsquoexamen direct sans concentration -Lexamen direct est le seule examen qui permet drsquoappreacutecier la vitaliteacute des

parasites

-Il met en eacutevidence les kystes et les formes veacutegeacutetatives de protozoaires ainsi

quelques oeufs et les larves dhelminthes

- On peut rajouter du Lugol double sur la lame qui fixe et colore les

structure nucleacuteaires

- Quelque soit le reacutesultat de lrsquoexamen direct on doit obligatoirement le

compleacuteter par deux techniques de concentration lrsquoune pour les kystes et

lrsquoautre pour les oeufs

- Il est impeacuteratif de connaitre la deacutescription des eacuteleacutements parasitaire et

de retenir les possibles faux parasites

Lrsquoobservation microscopique

une noisette de selle

(agrave diffeacuterents endroits)

lrsquoeau physiologique

agrave 09

suspension homogegravene

2 gouttes sur une

lame recouvrir par

une lamelle

lecture en

zig-zag x10

x 40

+

Les meacutethodes de concentrations

Les techniques par lesquelles on

essaie agrave partir de la grande quantiteacute

de la matieres feacutecales recueillies

drsquoobtenir dans un faible volume les

œufs larves kystes voire formes

veacutegeacutetatifs fixeacutees de parasites par

eacutelimination des reacutesidus de la

digestion

Les meacutethodes physiques

Les selles dilueacutees dans un reacuteactif de densiteacute

diffeacuterente de celle de parasite

DR superieur DP = flottation

DR inferieur DP = seacutedimentation

A-Techniques de flottation

Crsquoest une technique part du principe que la densiteacute du liquide et supeacuterieur

agrave celle des parasites ces derniers plus leacutegers flottent agrave la surface

Les principales techniques de flottation

- Meacutethode de Fullborn (1920) elle utilise une solution satureacutee de NaCl

(NaCl 250g ED 750ml d=12)

- Meacutethode de Willis (1921) simple et utilisable en routine

bullDiluer une noisette de selle dans la solution satureacutee de NaCl agrave 25

bullRemplissez un tube en verre conique jusquagrave sonbord en formant un

meacutenisque concave (verre de montre) sur lequel on deacutepose une lamelle

pendant 15 minutes (pas plus pour eacuteviter la cristalisation des oeufs) On la

deacutepose ensuite sur une lame porte objet et on observe agrave lrsquoobjectif X10 agrave la

recherche des OEufs drsquohelminthes tels que ceux drsquoHymenolepis ou

drsquoAnkylstomes

-Meacutethode de Janeckso et Urbanyi(1931) utilise comme reacuteactif une

solution de domercurate de potassium ( d=114) qui doit etre manipuleacutee

avec prudence

Iodo-mercurate de potassium

Bi iodure de mercure 100g

Iodure de potassium 74g

Eau distilleacutee 50 ml

-Meacutethode de Faust (1938) on centrifuge agrave 1500 tm une dilution des

selles dans lrsquoeau ordinaire tieacutede et on rejette le surnageant et on remet le

culot en suspension dans drsquoeau On reacutepegravete lrsquoopeacuteration jusqursquoagrave ce que le

surnageant soit limpide on remet alors le culot en suspension dans le

sulfate de Zink agrave 33 Apreacutes centrifugation on preacutelegraveve agrave lrsquoanse de

platine la pellicule de surfase qursquoon examine au microscope

- Meacutethode drsquoOtto Hwitt et Straham (1941) on procegravede de la meme

maniere que pour le Willis mais avec une solution aqueuse de sulfate

de Zink agrave 33 D=118

Avantage -Technique simple

-Mateacuteriel rudimentaire

- reacutealisation en seacuterie

-Sensibiliteacute treacutes bonne++++

Inconveacutenient

-Elle a ce pendant lrsquoinconveacutenient drsquoalteacuterer des Larves et les

Kystes pour les quels elle est contre-indiqueacutee ( reactifs

hypertoniques) de mecircme que pour les selles liquides ou

riches en lipides

-Elle donne de bons reacutesultats pour les oeufs drsquohelminthes

leacutegers (oeufs drsquoHymenolepis drsquoAnkylostome et deTaelignia)

B-Techniques de seacutedimentation bullLe diluant a une densiteacute inferieure agrave celle du

parasite alors se dernier se seacutedimente

Les principales techniques

- Meacutethode par seacutedimentation simple

- Meacutethode de Faust et IngallsReacutealiseacutee en utilisant

lrsquoeau glyceacuterineacutee (Eau + Glyceacuterine agrave 05) elle

permet drsquoaugmenter la mouillabiliteacute qui facilite la

seacutedimentation des parasites larves Anguillules

Œufs drsquoAscaris non feacutecondeacutes et œufs de

Schistosoma mansoni

-Meacutethode de Baroody et MostSeacutedimentation

centrifugation Eau de robinet chauffeacutee agrave 42degC

- Meacutethode de Jahnes et Hodges

Avantage -Technique simple

-Mateacuteriel rudimentaire

- reacutealisation en seacuterie

- Traitent une grande masse feacutecale ( parasites rares ou irreacuteguliegraverere ment

repartis dans la selle)

Inconveacutenient -une technique longue agrave reacutealiser

-Les cellules veacutegeacutetales seacutedimentent aussi vite que les parasites (Preacutesence

de certains reacutesidus)

-Non indiqueacutes en routine (sensibiliteacute

moyenne++)

Meacutethodes physico-chimiques ou

Diphasiques Caracteacuteriseacutees par la mise en preacutesence de deux

phases non miscibles lrsquoune aqueuse et lrsquoautre

constitueacutee par lrsquoeacutether qui est un solvant des lipidesil

se creacutee un coefficient de partage entre ces deux

phases et la reacutepartition de chaque eacuteleacutement feacutecal dans

chacune drsquoelles sera isoleacutes en fonction de son pouvoir

hydrophile ou lipophile

Bailenger a montreacute que le pH de la solution eacutetait

leacuteleacutement deacuteterminant pour la plus ou moins grande

efficaciteacute dune technique selon le parasite rechercheacute

Principes theacuteoriques

-Les selles tritureacutees (meacutelange au dixiegraveme environ) dans la solution choisie - elle peut ecirctre preacutealablement passeacutee sur un tamis pour eacuteliminer les gros deacutebris

le filtrat est verseacute dans un tube agrave centrifuger agrave fond conique en le remplissant 13

deacutether de maniegravere agrave ce quil y ai 23 du meacutelange selle en laissant 1 cm pour

fermer le tube

- Lrsquoagiter pendant une minute

- La suspension eacutetheacutero-liquide obtenue est centrifugeacutee agrave une vitesse lente de

lordre de 1500 agrave 2000 toursminute pendant une agrave trois minutes

- Apregraves centrifugation les constituants de la suspension sont reacutepartis en quatre

Couches

- Deacutecoller la couche des reacutesidus lipophiles agrave laide dune baguette de verre

- Retourner le tube au dessus de leacutevier (en faisant couler de leau) ou dun bac agrave

deacutechets liquides

- Essuyer les parois du tube avec un coton tenu agrave la pince en laissant toujours le

tube avec louverture dirigeacutee vers le bas pour eacuteviter de souiller le culot avec les

reacutesidus

- Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique pour

remettre en suspension le culot qui sera examineacute

- le culot qui nous inteacuteresse qui contient les eacuteleacutement parasitaires (kystes des

protozoaires)

Ether Debris

Phase aqueuse

Le culot

Les meacutethodes diphasiques sont

-Meacutethode de Telmann 1908

-Meacutethode De Rivas 1928

-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917

-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946

-Meacutethode De Ritchie 1948

-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood

-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf

-Meacutethode De Roman 1957

-Meacutethode de Bailenger 1962-1963

-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle

-Meacutethode de Junod 1927

Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage

Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia

Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)

La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble

lors de la centrifugation ce qui est un argument

diagnostique inteacuteressant

- Inconveacutenients

Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve

restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave

deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses

- Deacuteroulement de la technique

acide aceacutetique cristallisable 5 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethode de Bailenger - Avantages

Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et

des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5

(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)

- Inconveacutenients

Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre

technique est neacutecessaire

- Deacuteroulement de la technique

aceacutetate de sodium 15 g

acide aceacutetique 36 ml

eau distilleacutee qsp 1000 ml

Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide

dun pH-megravetre

Meacutethode de Ritchie simplifieacutee

- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles

formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour

enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les

oeufs dascaris et de schistosome

- Inconveacutenients

Le culot souvent volumineux est de lecture difficile

- Deacuteroulement de la technique

- Solutions de Ritchie

eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt

eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)

Meacutethode de Blagg et al

-Avantages

-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire

les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de

liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de

mercure souille les effluents du laboratoire

- Deacuteroulement de la technique

Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou

additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est

verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation

eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes

Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)

permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute

Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et

recommencer lagitation

On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et

cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee

Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages

-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles

Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes

aiseacutement et facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de

schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue

que les techniques en un temps

- Deacuteroulement de la technique

A) NaCl 9 g

formol officinal 10 ml

eau qsp 1000 ml

B) acide citrique 100 g

formol officinal 20 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethodes combineacutees

Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et

par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande

quantiteacute de selles

Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les

rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des

formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale

- Inconveacutenients

Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez

mal - Deacuteroulement de la technique

A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml

formol officinal 100 ml

eau qsp 1 000 ml

B bromure de sodium cristalliseacute 622 g

eau distilleacutee 1000 ml

Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant

pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou

kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour

trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente

- Inconveacutenients

Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps

assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate

preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)

- Deacuteroulement de la technique

- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)

liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml

eau distilleacutee 334 ml

Concentration diphasique

(MIF ou Bailenger)

une solution de

sulfate de zinc

30 secondes agrave f v

dilueacute au quart avec ED

Examiner

Le culot

Examiner

Le culot

iodomercurate

de potassium

de densiteacute 15

dilueacute au quart avec ED

Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod

simplifieacutee) - Avantages

donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete

- Inconveacutenients

Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi

dune solution de iodomercurate

- Deacuteroulement de la technique

Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)

- aceacutetate de sodium 15 g

- acide aceacutetique cristallisable 20 ml

- formol 40 ml

-eau qsp 1000 ml

Solution B (densiteacute 140)

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 442 volumes

8 g de selles

50 ml de solution de NaCl agrave

85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min

Suspension homo

+Tamisage Examiner

Le culot

eacuteliminer

le surnageant

20 ml dune solution A

+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique

1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min

4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer

le surnageant

Examiner

Le culot

Meacutethode de seacutedimentation-flottation

pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves

- Inconveacutenients

Quand la teneur des selles en lipides est anormalement

eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de

graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique

Solution de densiteacute 135

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 520 volumes

la suspension feacutecale en

eau agrave 85 de NaCl

1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min

1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min

20 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacute

eacuteliminer

le surnageant

5 agrave 7 ml de solution diodomercurate

de potassium de densiteacute 135 20 ml deau

Examen du culot

Seacutedimentation-flottation au saccharose

pour protozoaires - Avantages

permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les

kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand

lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste

na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des

selles fixeacutees au MIF

- Inconveacutenients

Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et

flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De

plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre

que des sels de mercure sont encore utiliseacutes

-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose

saccharose 120 g

eau 200 ml

Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et

utiliser alors

saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml

Suspension homo

+Tamisage +

2 agrave 3 heures

50 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacutee

fraicircche

10 agrave 15 ml de la suspension

1800-2000 toursmin 90sec

rejeter le surnageant

L 1 en12humide

3 agrave 4 g de selles

Seacute

dim

en

tatio

n

8 agrave 10 ml de solution de saccharose

+ 05 ml de solution de chlorure

mercurique agrave 15 en ED

1000 toursmin 45 sec

deacutecanter le

surnageant

dans T2

L 2 en12humide

Flottation

T2 20 agrave 30 ml deau

2000 toursmin90 sec

L 3 en12humide

Preacutecipitation

Les colorations

utile en cas de doute lrsquoidentification des

kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces

des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires

coloreacutees

recommandeacutee pour la conservation de

mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre

laboratoire pour avis

indispensable pour le diagnostic de certains

parasites (Cryptosporides microsporides)

Meacutethodes de coloration rapides

(Colorations en tubes)

- Meacutethode de Bailenger et Faraggi

- Meacutethode de Sapro Lawless et

Strome

-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene

tamporeacute

-Meacutethode de Horkin

- Meacutethode de Sargeaut

-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero

Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de

Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-

formol Apregraves meacutelange

- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave

laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout

-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le

fond du tube

-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en

protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees

immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine

des noyaux est coloreacutee en brun par liode

Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent

donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol

sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement

leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes

- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou

directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension

de selles avec le colorant

Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des

protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux

apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs

jours

la coloration de Bailenger

Laisser pendant une nuit en contact

cristal violet 2 g

fuchsine basique 005 g

alcool agrave 95deg 20 ml

pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml

eau distilleacutee 100 ml

Coloration des frottis

Pour bien observer les structures nucleacuteaires et

garder des lames de reacutefeacuterence on

confectionne un frottis de selles humide et

eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en

- 3 temps fixation puis coloration puis

diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)

- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg

Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)

Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag

- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher

soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains

dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)

soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)

soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1

heure)

-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode

-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau

- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3

30 min agrave leacutetuve agrave 37deg

- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece

24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs

-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au

microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent

nettement

-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau

-Deacuteshydrater

-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est

poseacutee deacutefinitivement

- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les

trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure

des noyaux Les kystes apparaissent en bleu

pacircle avec des noyaux bien nets Cest une

technique facile agrave reacutealiser

- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible

- Plonger la lame dans le fixateur colorant de

Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures

- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au

baume de Canada ou au baume syntheacutetique

Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par

Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie

- Seacutechage

- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol

- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid

- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet

- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20

secondes en agitant

- Rinccedilage

-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5

- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100

- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert

Coloration des microscporidies

Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10

- Effectuer un frottis de la selle

- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de

meacutethanol

- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes

- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord

en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml

- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge

Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee

microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-

Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution

- Colorer pendant 3 heures

- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02

-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-

Rincer seacutecher et lire au grossissement x100

Coloration par Uvitex 2B

Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute

pour la chitine Met en eacutevidence les

microsporidie par une fluorescence

directe On obtient une

fluorescence bleue pale sur fond

noir

Scotch test anal ( test de Graham agrave

la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius

vermicularis ainsi que les anneaux ou les

oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors

de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est

appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant

toute toilette en position foetale ou genou

pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus

et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute

sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera

agrave lrsquoobjectif X10

NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les

parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que

la technique devra ecirctre faite avec des gants

ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite

pour eacuteviter la contamination par les oeufs

auto-infestant de lrsquooxyure

Meacutethodes speacuteciales

Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon

eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs

drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle

de la taille drsquoun petit pois

Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen

des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm

dans une quantiteacute de vert malachite agrave

3 (contre colorant) et de glyceacuterine

appliquer la bande sur la selle et sur la

lame renverser et appuyer sur la

paillasse

Methode de Kato-Katz quantitative

utilise un gabarie pour la selle

Meacutethode efficace pour la recherche

doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale

mais inutilisable pour les kytes et les

larves ainsi que les oeufs dankylostome

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

Maladie parasitaire

-Historique

-Le parasite biologie

-Reacutepartition geacuteographique

-Description clinique

-Pathogeacutenie

-Deacutefense de lrsquoorganisme

-Diagnostic

biologique -Theacuterapeutique

-Prophylaxie

Modes de parasitisme

Localisation

Classification

Cycle eacutevolutif

-D drsquoorientation clinique

-D direct ou parasitologique

-D indirect ou immunologique

DIAGNOSTIC DIRECTE

PRELEVEMENT

PREPARATION

LrsquoEXAMEN

Selle urine sang

vaginaux ureacutetraux

Cutaneacutes autres

Cleacutes de deacutetermination

des œufs et larves

Chaque parasite nrsquoest

bien mis en eacutevidence

que par la technique qui

lui est adapteacute

Un examen neacutegatif isoleacute nrsquoa aucune valeur drsquoeacutelimination

Seacutecuriteacute au laboratoire (principes geacuteneacuteraux)

-un manuel des consignes de seacutecuriteacute au

laboratoire

-trousse de secours

-vecirctements protecteurs

-nettoyer les paillasses (deacutetergent et

deacutesinfectent les surfaces)

-se laver les mains

-manipulation des preacutelegravevements exige des

preacutecautions particuliegraveres surtouts en cas des

preacutelegravevement de sang (potentiellement

infectieux)

-eacutelimination des lames porte-objets

Entretien du microscope

Ce que vous devez faire

Etalonnage du microscope

taille est un critegravere important

(kyste et œufs)

cellule heacutematimegravetrique

un micromegravetre oculaire

LA COPROLOGIE

PARASITAIRE

Chapitre 1 Premiegraveres observations des parasites

La coprologie parasitaire ou lrsquoexamen parasitologique des

selles EPS met en eacutevidence et identifie

Les parasites vivants dans le tube digestif Ex Protozoaires et

helminthes (Ascaris lumbricoides tronguiloides stercoralis)

Les parasites pour les quelles les selles sont un moyen drsquoeacutelimination de

leur forme de disseacutemination dans le milieu exteacuterieur Ex Schistosoma mansoni

(vit dans le plexus veineux)

LrsquoEPS mettra en eacutevidence

- une partie du parasite Ex Anneaux deTaenia saginata qui se deacutetachent en

dehors des selles

- une forme eacutevolutive du parasite (larve et oeuf drsquohelminthe) Ex oeuf

drsquoAncylostoma duodenalis

- la forme deacutefinitive du parasite Ex adulte drsquohelminthe Strongyloides stercoralis

les formes veacutegeacutetatives des amibes et des flagelleacutes sont

fragiles dans le milieu exteacuterieur

Preacuteparation du malade

Reacutegime alimentaire limiteacute avant de faire lrsquoexamen Eacuteviter de consommer Les fruits agrave cuticule dure (poires

pommes) Feacuteculents et graines agrave enveloppes segraveches

(lentillefegraveves) Foie drsquoovins ou de bovins

Arrecircter des meacutedicaments - Les antiseptiques intestinaux

- Les antibiotiques et les sulfamides

- Les laxatifs tels que le bismuth le charbon lhuile de paraffine

les suppositoires

--Ne pas faire de radiologie digestive utilisant des produits de

contraste comme la baryte

Fiche clinique

acircge sexe adresse animaux de compagnie profession

(veacuteteacuterinaire agriculteur) habitudes alimentaires statut

immunitaire

PRELEVEMENT

Nombre de preacutelegravevements

Une seul analyse ne permet de deacuteceler la preacutesense

drsquoeacuteleacutements parasitaires que dans 30 des cas

- Rareteacute des eacuteleacutements parasitaires

- Efficaciteacute des techniques utiliseacutees

-Une peacuteriode muette de rejet des eacutelements

caracteacuteristiques (giardiase amibiase)

Il faut dans lrsquoideal pratiquer trois

examens coprologiques agrave quelques

jours drsquointervalle pour affirmer la

neacutegativiteacute

Recueil des selles

-Reacutecipient propre et sec agrave bouchage hermeacutetique

-faire recueillir lrsquoensemble de lrsquoeacutemission

-etiquetage prescripteur nom du patient date

du preacutelegravevement et traitement observeacute si il existe

- les selles ne doit surtout pas ecirctre meacutelanger aux

urines (destruction des formes veacutegeacutetatives)

Deacutelai drsquoexamen

Il faut que la selle parvienne dans les plus brefs deacutelais au

laboratoire afin drsquoeacuteviter la deacutegeacuteneacuterescence des formes

veacutegeacutetatives des protozoaires qui sont sensible agrave la variation

de tempeacuteratures et agrave la deacuteshydratation

Techniques de conservation

Conservation provisoire par le froid (+4degC)

-Bonne conservation des kystes de protozoaires etou

œufs drsquohelminthes

-Mort rapide des trophozoites de protozoaire

-Mort les larves drsquoanguilules

Meacutethode agrave lrsquoeau formoleacutee ( fixation conservation)

-Aldehyde formique( formol) de 5 agrave 20

-Glyceacuterine( facultatif)

-Eau distilleacutee ou lrsquoeau physiologique 100ml La selle +

3 vol 1 vol

tamiser Sedimenter stoker

Bonne conservation œufs drsquohelminthe et kystes de

protozoaires tant que le preacutelegravevement reste liquide

Fixation au MIF (Merthiolate-Iode-Formol)

SOLUTION 1 de mercurothiolate iode

ndashformol

-teinture de mercurethiolate 200 ml

-glycerine 5 ml

-formol agrave 40 25 ml

-eau distilleacutee 250 ml

SOLUTION 2 de Lugol

-iode 05 g

-iode de potassium 1g

-eau distilleacutee 10 ml

1175 ml 075ml +

3 agrave 5 g selles

Triturer stoker

Conservation beaucoups plus longue des

formes veacutegeacutetatives et les kystes de protozoaires

Meacutelange fixateur agrave lrsquoalcool polyvinylique APV

APV

-alcool polyvinylique en poudre

5g

-glyceacuterol 15ml

-eau distilleacutee 625 ml

un bain marie ( 70 -75degC)10mn

Fixateur de Schaudinn modifieacute

-cristaux de clorure de mercure HgCl2

15g

-ethanol agrave 95 31 ml

Acide aceacutetique glacial 5ml +

2 agrave 3 mn

-Bonne conservation

-Une fixtion permettant de pratiquer des

frottis pouvant etre coloreacutes

Concervation des vers

Neacutematotes

Treacutematodes

cestodes

+ eau physiologique Entre 2 lames

Plongeacutes dan un fixteur

Ex - alcool 70 bouillant

- meacutelange alcool et formol

Aspect normal de la selle - poids de 110 agrave 150 g

- couleur brune

- Une consistance ferme et un aspect mouleacute

-- Un pH drsquoenviron 7

Microscopiquement en doit observeacute

-- Des fibres musculaires

-- De la cellulose non digestible poils vaisseaux

ligneux eacuteleacutements scleacutereux

-- de lrsquoamidon si le reacutegime est riche en feacuteculents et chez

lrsquoenfant

-- Quelques masses amorphes ou disques radieacutes ( les

savons)

-- il ne doit pas avoir de globules gras ( graisses

neutres)

COPROLOGIE PARASITAIRE Conduite de lrsquoexamen

1048766 Examen macroscopique

1048766 Examen microscopique

- Examen direct sans concentration

- Examen direct apreacutes concentration

- Les meacutethodes physiques

- Techniques de flottation

- Techniques de seacutedimentation

- Les meacutethodes physico-chimiques

- Les meacutethodes combineacutees

-Colorations speacutecifiques

- cultures

- Examens particuliers

Lrsquoobservation macroscopique Il permet de noter

- Couleur ( brune jaune ou ocre verte

deacutecoloreacutee noire rouge)

- consistance (molle dure liquide)

- aspect (preacutesence de bulles ou de gras

steacuteatorrheacutee)

- Preacutesence drsquoeacuteleacutements surajouteacutes

-Parasites adulte drsquoAscaris femelle drsquooxuyre

anneau ou chaine de taenia

-glaire (mucus)

-sang de pus

Lrsquoexamen direct sans concentration -Lexamen direct est le seule examen qui permet drsquoappreacutecier la vitaliteacute des

parasites

-Il met en eacutevidence les kystes et les formes veacutegeacutetatives de protozoaires ainsi

quelques oeufs et les larves dhelminthes

- On peut rajouter du Lugol double sur la lame qui fixe et colore les

structure nucleacuteaires

- Quelque soit le reacutesultat de lrsquoexamen direct on doit obligatoirement le

compleacuteter par deux techniques de concentration lrsquoune pour les kystes et

lrsquoautre pour les oeufs

- Il est impeacuteratif de connaitre la deacutescription des eacuteleacutements parasitaire et

de retenir les possibles faux parasites

Lrsquoobservation microscopique

une noisette de selle

(agrave diffeacuterents endroits)

lrsquoeau physiologique

agrave 09

suspension homogegravene

2 gouttes sur une

lame recouvrir par

une lamelle

lecture en

zig-zag x10

x 40

+

Les meacutethodes de concentrations

Les techniques par lesquelles on

essaie agrave partir de la grande quantiteacute

de la matieres feacutecales recueillies

drsquoobtenir dans un faible volume les

œufs larves kystes voire formes

veacutegeacutetatifs fixeacutees de parasites par

eacutelimination des reacutesidus de la

digestion

Les meacutethodes physiques

Les selles dilueacutees dans un reacuteactif de densiteacute

diffeacuterente de celle de parasite

DR superieur DP = flottation

DR inferieur DP = seacutedimentation

A-Techniques de flottation

Crsquoest une technique part du principe que la densiteacute du liquide et supeacuterieur

agrave celle des parasites ces derniers plus leacutegers flottent agrave la surface

Les principales techniques de flottation

- Meacutethode de Fullborn (1920) elle utilise une solution satureacutee de NaCl

(NaCl 250g ED 750ml d=12)

- Meacutethode de Willis (1921) simple et utilisable en routine

bullDiluer une noisette de selle dans la solution satureacutee de NaCl agrave 25

bullRemplissez un tube en verre conique jusquagrave sonbord en formant un

meacutenisque concave (verre de montre) sur lequel on deacutepose une lamelle

pendant 15 minutes (pas plus pour eacuteviter la cristalisation des oeufs) On la

deacutepose ensuite sur une lame porte objet et on observe agrave lrsquoobjectif X10 agrave la

recherche des OEufs drsquohelminthes tels que ceux drsquoHymenolepis ou

drsquoAnkylstomes

-Meacutethode de Janeckso et Urbanyi(1931) utilise comme reacuteactif une

solution de domercurate de potassium ( d=114) qui doit etre manipuleacutee

avec prudence

Iodo-mercurate de potassium

Bi iodure de mercure 100g

Iodure de potassium 74g

Eau distilleacutee 50 ml

-Meacutethode de Faust (1938) on centrifuge agrave 1500 tm une dilution des

selles dans lrsquoeau ordinaire tieacutede et on rejette le surnageant et on remet le

culot en suspension dans drsquoeau On reacutepegravete lrsquoopeacuteration jusqursquoagrave ce que le

surnageant soit limpide on remet alors le culot en suspension dans le

sulfate de Zink agrave 33 Apreacutes centrifugation on preacutelegraveve agrave lrsquoanse de

platine la pellicule de surfase qursquoon examine au microscope

- Meacutethode drsquoOtto Hwitt et Straham (1941) on procegravede de la meme

maniere que pour le Willis mais avec une solution aqueuse de sulfate

de Zink agrave 33 D=118

Avantage -Technique simple

-Mateacuteriel rudimentaire

- reacutealisation en seacuterie

-Sensibiliteacute treacutes bonne++++

Inconveacutenient

-Elle a ce pendant lrsquoinconveacutenient drsquoalteacuterer des Larves et les

Kystes pour les quels elle est contre-indiqueacutee ( reactifs

hypertoniques) de mecircme que pour les selles liquides ou

riches en lipides

-Elle donne de bons reacutesultats pour les oeufs drsquohelminthes

leacutegers (oeufs drsquoHymenolepis drsquoAnkylostome et deTaelignia)

B-Techniques de seacutedimentation bullLe diluant a une densiteacute inferieure agrave celle du

parasite alors se dernier se seacutedimente

Les principales techniques

- Meacutethode par seacutedimentation simple

- Meacutethode de Faust et IngallsReacutealiseacutee en utilisant

lrsquoeau glyceacuterineacutee (Eau + Glyceacuterine agrave 05) elle

permet drsquoaugmenter la mouillabiliteacute qui facilite la

seacutedimentation des parasites larves Anguillules

Œufs drsquoAscaris non feacutecondeacutes et œufs de

Schistosoma mansoni

-Meacutethode de Baroody et MostSeacutedimentation

centrifugation Eau de robinet chauffeacutee agrave 42degC

- Meacutethode de Jahnes et Hodges

Avantage -Technique simple

-Mateacuteriel rudimentaire

- reacutealisation en seacuterie

- Traitent une grande masse feacutecale ( parasites rares ou irreacuteguliegraverere ment

repartis dans la selle)

Inconveacutenient -une technique longue agrave reacutealiser

-Les cellules veacutegeacutetales seacutedimentent aussi vite que les parasites (Preacutesence

de certains reacutesidus)

-Non indiqueacutes en routine (sensibiliteacute

moyenne++)

Meacutethodes physico-chimiques ou

Diphasiques Caracteacuteriseacutees par la mise en preacutesence de deux

phases non miscibles lrsquoune aqueuse et lrsquoautre

constitueacutee par lrsquoeacutether qui est un solvant des lipidesil

se creacutee un coefficient de partage entre ces deux

phases et la reacutepartition de chaque eacuteleacutement feacutecal dans

chacune drsquoelles sera isoleacutes en fonction de son pouvoir

hydrophile ou lipophile

Bailenger a montreacute que le pH de la solution eacutetait

leacuteleacutement deacuteterminant pour la plus ou moins grande

efficaciteacute dune technique selon le parasite rechercheacute

Principes theacuteoriques

-Les selles tritureacutees (meacutelange au dixiegraveme environ) dans la solution choisie - elle peut ecirctre preacutealablement passeacutee sur un tamis pour eacuteliminer les gros deacutebris

le filtrat est verseacute dans un tube agrave centrifuger agrave fond conique en le remplissant 13

deacutether de maniegravere agrave ce quil y ai 23 du meacutelange selle en laissant 1 cm pour

fermer le tube

- Lrsquoagiter pendant une minute

- La suspension eacutetheacutero-liquide obtenue est centrifugeacutee agrave une vitesse lente de

lordre de 1500 agrave 2000 toursminute pendant une agrave trois minutes

- Apregraves centrifugation les constituants de la suspension sont reacutepartis en quatre

Couches

- Deacutecoller la couche des reacutesidus lipophiles agrave laide dune baguette de verre

- Retourner le tube au dessus de leacutevier (en faisant couler de leau) ou dun bac agrave

deacutechets liquides

- Essuyer les parois du tube avec un coton tenu agrave la pince en laissant toujours le

tube avec louverture dirigeacutee vers le bas pour eacuteviter de souiller le culot avec les

reacutesidus

- Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique pour

remettre en suspension le culot qui sera examineacute

- le culot qui nous inteacuteresse qui contient les eacuteleacutement parasitaires (kystes des

protozoaires)

Ether Debris

Phase aqueuse

Le culot

Les meacutethodes diphasiques sont

-Meacutethode de Telmann 1908

-Meacutethode De Rivas 1928

-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917

-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946

-Meacutethode De Ritchie 1948

-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood

-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf

-Meacutethode De Roman 1957

-Meacutethode de Bailenger 1962-1963

-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle

-Meacutethode de Junod 1927

Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage

Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia

Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)

La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble

lors de la centrifugation ce qui est un argument

diagnostique inteacuteressant

- Inconveacutenients

Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve

restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave

deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses

- Deacuteroulement de la technique

acide aceacutetique cristallisable 5 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethode de Bailenger - Avantages

Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et

des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5

(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)

- Inconveacutenients

Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre

technique est neacutecessaire

- Deacuteroulement de la technique

aceacutetate de sodium 15 g

acide aceacutetique 36 ml

eau distilleacutee qsp 1000 ml

Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide

dun pH-megravetre

Meacutethode de Ritchie simplifieacutee

- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles

formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour

enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les

oeufs dascaris et de schistosome

- Inconveacutenients

Le culot souvent volumineux est de lecture difficile

- Deacuteroulement de la technique

- Solutions de Ritchie

eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt

eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)

Meacutethode de Blagg et al

-Avantages

-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire

les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de

liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de

mercure souille les effluents du laboratoire

- Deacuteroulement de la technique

Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou

additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est

verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation

eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes

Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)

permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute

Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et

recommencer lagitation

On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et

cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee

Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages

-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles

Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes

aiseacutement et facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de

schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue

que les techniques en un temps

- Deacuteroulement de la technique

A) NaCl 9 g

formol officinal 10 ml

eau qsp 1000 ml

B) acide citrique 100 g

formol officinal 20 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethodes combineacutees

Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et

par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande

quantiteacute de selles

Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les

rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des

formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale

- Inconveacutenients

Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez

mal - Deacuteroulement de la technique

A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml

formol officinal 100 ml

eau qsp 1 000 ml

B bromure de sodium cristalliseacute 622 g

eau distilleacutee 1000 ml

Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant

pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou

kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour

trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente

- Inconveacutenients

Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps

assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate

preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)

- Deacuteroulement de la technique

- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)

liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml

eau distilleacutee 334 ml

Concentration diphasique

(MIF ou Bailenger)

une solution de

sulfate de zinc

30 secondes agrave f v

dilueacute au quart avec ED

Examiner

Le culot

Examiner

Le culot

iodomercurate

de potassium

de densiteacute 15

dilueacute au quart avec ED

Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod

simplifieacutee) - Avantages

donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete

- Inconveacutenients

Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi

dune solution de iodomercurate

- Deacuteroulement de la technique

Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)

- aceacutetate de sodium 15 g

- acide aceacutetique cristallisable 20 ml

- formol 40 ml

-eau qsp 1000 ml

Solution B (densiteacute 140)

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 442 volumes

8 g de selles

50 ml de solution de NaCl agrave

85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min

Suspension homo

+Tamisage Examiner

Le culot

eacuteliminer

le surnageant

20 ml dune solution A

+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique

1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min

4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer

le surnageant

Examiner

Le culot

Meacutethode de seacutedimentation-flottation

pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves

- Inconveacutenients

Quand la teneur des selles en lipides est anormalement

eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de

graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique

Solution de densiteacute 135

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 520 volumes

la suspension feacutecale en

eau agrave 85 de NaCl

1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min

1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min

20 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacute

eacuteliminer

le surnageant

5 agrave 7 ml de solution diodomercurate

de potassium de densiteacute 135 20 ml deau

Examen du culot

Seacutedimentation-flottation au saccharose

pour protozoaires - Avantages

permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les

kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand

lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste

na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des

selles fixeacutees au MIF

- Inconveacutenients

Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et

flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De

plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre

que des sels de mercure sont encore utiliseacutes

-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose

saccharose 120 g

eau 200 ml

Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et

utiliser alors

saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml

Suspension homo

+Tamisage +

2 agrave 3 heures

50 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacutee

fraicircche

10 agrave 15 ml de la suspension

1800-2000 toursmin 90sec

rejeter le surnageant

L 1 en12humide

3 agrave 4 g de selles

Seacute

dim

en

tatio

n

8 agrave 10 ml de solution de saccharose

+ 05 ml de solution de chlorure

mercurique agrave 15 en ED

1000 toursmin 45 sec

deacutecanter le

surnageant

dans T2

L 2 en12humide

Flottation

T2 20 agrave 30 ml deau

2000 toursmin90 sec

L 3 en12humide

Preacutecipitation

Les colorations

utile en cas de doute lrsquoidentification des

kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces

des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires

coloreacutees

recommandeacutee pour la conservation de

mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre

laboratoire pour avis

indispensable pour le diagnostic de certains

parasites (Cryptosporides microsporides)

Meacutethodes de coloration rapides

(Colorations en tubes)

- Meacutethode de Bailenger et Faraggi

- Meacutethode de Sapro Lawless et

Strome

-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene

tamporeacute

-Meacutethode de Horkin

- Meacutethode de Sargeaut

-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero

Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de

Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-

formol Apregraves meacutelange

- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave

laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout

-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le

fond du tube

-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en

protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees

immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine

des noyaux est coloreacutee en brun par liode

Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent

donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol

sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement

leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes

- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou

directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension

de selles avec le colorant

Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des

protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux

apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs

jours

la coloration de Bailenger

Laisser pendant une nuit en contact

cristal violet 2 g

fuchsine basique 005 g

alcool agrave 95deg 20 ml

pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml

eau distilleacutee 100 ml

Coloration des frottis

Pour bien observer les structures nucleacuteaires et

garder des lames de reacutefeacuterence on

confectionne un frottis de selles humide et

eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en

- 3 temps fixation puis coloration puis

diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)

- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg

Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)

Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag

- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher

soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains

dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)

soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)

soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1

heure)

-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode

-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau

- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3

30 min agrave leacutetuve agrave 37deg

- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece

24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs

-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au

microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent

nettement

-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau

-Deacuteshydrater

-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est

poseacutee deacutefinitivement

- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les

trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure

des noyaux Les kystes apparaissent en bleu

pacircle avec des noyaux bien nets Cest une

technique facile agrave reacutealiser

- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible

- Plonger la lame dans le fixateur colorant de

Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures

- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au

baume de Canada ou au baume syntheacutetique

Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par

Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie

- Seacutechage

- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol

- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid

- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet

- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20

secondes en agitant

- Rinccedilage

-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5

- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100

- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert

Coloration des microscporidies

Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10

- Effectuer un frottis de la selle

- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de

meacutethanol

- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes

- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord

en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml

- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge

Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee

microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-

Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution

- Colorer pendant 3 heures

- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02

-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-

Rincer seacutecher et lire au grossissement x100

Coloration par Uvitex 2B

Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute

pour la chitine Met en eacutevidence les

microsporidie par une fluorescence

directe On obtient une

fluorescence bleue pale sur fond

noir

Scotch test anal ( test de Graham agrave

la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius

vermicularis ainsi que les anneaux ou les

oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors

de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est

appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant

toute toilette en position foetale ou genou

pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus

et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute

sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera

agrave lrsquoobjectif X10

NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les

parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que

la technique devra ecirctre faite avec des gants

ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite

pour eacuteviter la contamination par les oeufs

auto-infestant de lrsquooxyure

Meacutethodes speacuteciales

Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon

eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs

drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle

de la taille drsquoun petit pois

Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen

des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm

dans une quantiteacute de vert malachite agrave

3 (contre colorant) et de glyceacuterine

appliquer la bande sur la selle et sur la

lame renverser et appuyer sur la

paillasse

Methode de Kato-Katz quantitative

utilise un gabarie pour la selle

Meacutethode efficace pour la recherche

doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale

mais inutilisable pour les kytes et les

larves ainsi que les oeufs dankylostome

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

DIAGNOSTIC DIRECTE

PRELEVEMENT

PREPARATION

LrsquoEXAMEN

Selle urine sang

vaginaux ureacutetraux

Cutaneacutes autres

Cleacutes de deacutetermination

des œufs et larves

Chaque parasite nrsquoest

bien mis en eacutevidence

que par la technique qui

lui est adapteacute

Un examen neacutegatif isoleacute nrsquoa aucune valeur drsquoeacutelimination

Seacutecuriteacute au laboratoire (principes geacuteneacuteraux)

-un manuel des consignes de seacutecuriteacute au

laboratoire

-trousse de secours

-vecirctements protecteurs

-nettoyer les paillasses (deacutetergent et

deacutesinfectent les surfaces)

-se laver les mains

-manipulation des preacutelegravevements exige des

preacutecautions particuliegraveres surtouts en cas des

preacutelegravevement de sang (potentiellement

infectieux)

-eacutelimination des lames porte-objets

Entretien du microscope

Ce que vous devez faire

Etalonnage du microscope

taille est un critegravere important

(kyste et œufs)

cellule heacutematimegravetrique

un micromegravetre oculaire

LA COPROLOGIE

PARASITAIRE

Chapitre 1 Premiegraveres observations des parasites

La coprologie parasitaire ou lrsquoexamen parasitologique des

selles EPS met en eacutevidence et identifie

Les parasites vivants dans le tube digestif Ex Protozoaires et

helminthes (Ascaris lumbricoides tronguiloides stercoralis)

Les parasites pour les quelles les selles sont un moyen drsquoeacutelimination de

leur forme de disseacutemination dans le milieu exteacuterieur Ex Schistosoma mansoni

(vit dans le plexus veineux)

LrsquoEPS mettra en eacutevidence

- une partie du parasite Ex Anneaux deTaenia saginata qui se deacutetachent en

dehors des selles

- une forme eacutevolutive du parasite (larve et oeuf drsquohelminthe) Ex oeuf

drsquoAncylostoma duodenalis

- la forme deacutefinitive du parasite Ex adulte drsquohelminthe Strongyloides stercoralis

les formes veacutegeacutetatives des amibes et des flagelleacutes sont

fragiles dans le milieu exteacuterieur

Preacuteparation du malade

Reacutegime alimentaire limiteacute avant de faire lrsquoexamen Eacuteviter de consommer Les fruits agrave cuticule dure (poires

pommes) Feacuteculents et graines agrave enveloppes segraveches

(lentillefegraveves) Foie drsquoovins ou de bovins

Arrecircter des meacutedicaments - Les antiseptiques intestinaux

- Les antibiotiques et les sulfamides

- Les laxatifs tels que le bismuth le charbon lhuile de paraffine

les suppositoires

--Ne pas faire de radiologie digestive utilisant des produits de

contraste comme la baryte

Fiche clinique

acircge sexe adresse animaux de compagnie profession

(veacuteteacuterinaire agriculteur) habitudes alimentaires statut

immunitaire

PRELEVEMENT

Nombre de preacutelegravevements

Une seul analyse ne permet de deacuteceler la preacutesense

drsquoeacuteleacutements parasitaires que dans 30 des cas

- Rareteacute des eacuteleacutements parasitaires

- Efficaciteacute des techniques utiliseacutees

-Une peacuteriode muette de rejet des eacutelements

caracteacuteristiques (giardiase amibiase)

Il faut dans lrsquoideal pratiquer trois

examens coprologiques agrave quelques

jours drsquointervalle pour affirmer la

neacutegativiteacute

Recueil des selles

-Reacutecipient propre et sec agrave bouchage hermeacutetique

-faire recueillir lrsquoensemble de lrsquoeacutemission

-etiquetage prescripteur nom du patient date

du preacutelegravevement et traitement observeacute si il existe

- les selles ne doit surtout pas ecirctre meacutelanger aux

urines (destruction des formes veacutegeacutetatives)

Deacutelai drsquoexamen

Il faut que la selle parvienne dans les plus brefs deacutelais au

laboratoire afin drsquoeacuteviter la deacutegeacuteneacuterescence des formes

veacutegeacutetatives des protozoaires qui sont sensible agrave la variation

de tempeacuteratures et agrave la deacuteshydratation

Techniques de conservation

Conservation provisoire par le froid (+4degC)

-Bonne conservation des kystes de protozoaires etou

œufs drsquohelminthes

-Mort rapide des trophozoites de protozoaire

-Mort les larves drsquoanguilules

Meacutethode agrave lrsquoeau formoleacutee ( fixation conservation)

-Aldehyde formique( formol) de 5 agrave 20

-Glyceacuterine( facultatif)

-Eau distilleacutee ou lrsquoeau physiologique 100ml La selle +

3 vol 1 vol

tamiser Sedimenter stoker

Bonne conservation œufs drsquohelminthe et kystes de

protozoaires tant que le preacutelegravevement reste liquide

Fixation au MIF (Merthiolate-Iode-Formol)

SOLUTION 1 de mercurothiolate iode

ndashformol

-teinture de mercurethiolate 200 ml

-glycerine 5 ml

-formol agrave 40 25 ml

-eau distilleacutee 250 ml

SOLUTION 2 de Lugol

-iode 05 g

-iode de potassium 1g

-eau distilleacutee 10 ml

1175 ml 075ml +

3 agrave 5 g selles

Triturer stoker

Conservation beaucoups plus longue des

formes veacutegeacutetatives et les kystes de protozoaires

Meacutelange fixateur agrave lrsquoalcool polyvinylique APV

APV

-alcool polyvinylique en poudre

5g

-glyceacuterol 15ml

-eau distilleacutee 625 ml

un bain marie ( 70 -75degC)10mn

Fixateur de Schaudinn modifieacute

-cristaux de clorure de mercure HgCl2

15g

-ethanol agrave 95 31 ml

Acide aceacutetique glacial 5ml +

2 agrave 3 mn

-Bonne conservation

-Une fixtion permettant de pratiquer des

frottis pouvant etre coloreacutes

Concervation des vers

Neacutematotes

Treacutematodes

cestodes

+ eau physiologique Entre 2 lames

Plongeacutes dan un fixteur

Ex - alcool 70 bouillant

- meacutelange alcool et formol

Aspect normal de la selle - poids de 110 agrave 150 g

- couleur brune

- Une consistance ferme et un aspect mouleacute

-- Un pH drsquoenviron 7

Microscopiquement en doit observeacute

-- Des fibres musculaires

-- De la cellulose non digestible poils vaisseaux

ligneux eacuteleacutements scleacutereux

-- de lrsquoamidon si le reacutegime est riche en feacuteculents et chez

lrsquoenfant

-- Quelques masses amorphes ou disques radieacutes ( les

savons)

-- il ne doit pas avoir de globules gras ( graisses

neutres)

COPROLOGIE PARASITAIRE Conduite de lrsquoexamen

1048766 Examen macroscopique

1048766 Examen microscopique

- Examen direct sans concentration

- Examen direct apreacutes concentration

- Les meacutethodes physiques

- Techniques de flottation

- Techniques de seacutedimentation

- Les meacutethodes physico-chimiques

- Les meacutethodes combineacutees

-Colorations speacutecifiques

- cultures

- Examens particuliers

Lrsquoobservation macroscopique Il permet de noter

- Couleur ( brune jaune ou ocre verte

deacutecoloreacutee noire rouge)

- consistance (molle dure liquide)

- aspect (preacutesence de bulles ou de gras

steacuteatorrheacutee)

- Preacutesence drsquoeacuteleacutements surajouteacutes

-Parasites adulte drsquoAscaris femelle drsquooxuyre

anneau ou chaine de taenia

-glaire (mucus)

-sang de pus

Lrsquoexamen direct sans concentration -Lexamen direct est le seule examen qui permet drsquoappreacutecier la vitaliteacute des

parasites

-Il met en eacutevidence les kystes et les formes veacutegeacutetatives de protozoaires ainsi

quelques oeufs et les larves dhelminthes

- On peut rajouter du Lugol double sur la lame qui fixe et colore les

structure nucleacuteaires

- Quelque soit le reacutesultat de lrsquoexamen direct on doit obligatoirement le

compleacuteter par deux techniques de concentration lrsquoune pour les kystes et

lrsquoautre pour les oeufs

- Il est impeacuteratif de connaitre la deacutescription des eacuteleacutements parasitaire et

de retenir les possibles faux parasites

Lrsquoobservation microscopique

une noisette de selle

(agrave diffeacuterents endroits)

lrsquoeau physiologique

agrave 09

suspension homogegravene

2 gouttes sur une

lame recouvrir par

une lamelle

lecture en

zig-zag x10

x 40

+

Les meacutethodes de concentrations

Les techniques par lesquelles on

essaie agrave partir de la grande quantiteacute

de la matieres feacutecales recueillies

drsquoobtenir dans un faible volume les

œufs larves kystes voire formes

veacutegeacutetatifs fixeacutees de parasites par

eacutelimination des reacutesidus de la

digestion

Les meacutethodes physiques

Les selles dilueacutees dans un reacuteactif de densiteacute

diffeacuterente de celle de parasite

DR superieur DP = flottation

DR inferieur DP = seacutedimentation

A-Techniques de flottation

Crsquoest une technique part du principe que la densiteacute du liquide et supeacuterieur

agrave celle des parasites ces derniers plus leacutegers flottent agrave la surface

Les principales techniques de flottation

- Meacutethode de Fullborn (1920) elle utilise une solution satureacutee de NaCl

(NaCl 250g ED 750ml d=12)

- Meacutethode de Willis (1921) simple et utilisable en routine

bullDiluer une noisette de selle dans la solution satureacutee de NaCl agrave 25

bullRemplissez un tube en verre conique jusquagrave sonbord en formant un

meacutenisque concave (verre de montre) sur lequel on deacutepose une lamelle

pendant 15 minutes (pas plus pour eacuteviter la cristalisation des oeufs) On la

deacutepose ensuite sur une lame porte objet et on observe agrave lrsquoobjectif X10 agrave la

recherche des OEufs drsquohelminthes tels que ceux drsquoHymenolepis ou

drsquoAnkylstomes

-Meacutethode de Janeckso et Urbanyi(1931) utilise comme reacuteactif une

solution de domercurate de potassium ( d=114) qui doit etre manipuleacutee

avec prudence

Iodo-mercurate de potassium

Bi iodure de mercure 100g

Iodure de potassium 74g

Eau distilleacutee 50 ml

-Meacutethode de Faust (1938) on centrifuge agrave 1500 tm une dilution des

selles dans lrsquoeau ordinaire tieacutede et on rejette le surnageant et on remet le

culot en suspension dans drsquoeau On reacutepegravete lrsquoopeacuteration jusqursquoagrave ce que le

surnageant soit limpide on remet alors le culot en suspension dans le

sulfate de Zink agrave 33 Apreacutes centrifugation on preacutelegraveve agrave lrsquoanse de

platine la pellicule de surfase qursquoon examine au microscope

- Meacutethode drsquoOtto Hwitt et Straham (1941) on procegravede de la meme

maniere que pour le Willis mais avec une solution aqueuse de sulfate

de Zink agrave 33 D=118

Avantage -Technique simple

-Mateacuteriel rudimentaire

- reacutealisation en seacuterie

-Sensibiliteacute treacutes bonne++++

Inconveacutenient

-Elle a ce pendant lrsquoinconveacutenient drsquoalteacuterer des Larves et les

Kystes pour les quels elle est contre-indiqueacutee ( reactifs

hypertoniques) de mecircme que pour les selles liquides ou

riches en lipides

-Elle donne de bons reacutesultats pour les oeufs drsquohelminthes

leacutegers (oeufs drsquoHymenolepis drsquoAnkylostome et deTaelignia)

B-Techniques de seacutedimentation bullLe diluant a une densiteacute inferieure agrave celle du

parasite alors se dernier se seacutedimente

Les principales techniques

- Meacutethode par seacutedimentation simple

- Meacutethode de Faust et IngallsReacutealiseacutee en utilisant

lrsquoeau glyceacuterineacutee (Eau + Glyceacuterine agrave 05) elle

permet drsquoaugmenter la mouillabiliteacute qui facilite la

seacutedimentation des parasites larves Anguillules

Œufs drsquoAscaris non feacutecondeacutes et œufs de

Schistosoma mansoni

-Meacutethode de Baroody et MostSeacutedimentation

centrifugation Eau de robinet chauffeacutee agrave 42degC

- Meacutethode de Jahnes et Hodges

Avantage -Technique simple

-Mateacuteriel rudimentaire

- reacutealisation en seacuterie

- Traitent une grande masse feacutecale ( parasites rares ou irreacuteguliegraverere ment

repartis dans la selle)

Inconveacutenient -une technique longue agrave reacutealiser

-Les cellules veacutegeacutetales seacutedimentent aussi vite que les parasites (Preacutesence

de certains reacutesidus)

-Non indiqueacutes en routine (sensibiliteacute

moyenne++)

Meacutethodes physico-chimiques ou

Diphasiques Caracteacuteriseacutees par la mise en preacutesence de deux

phases non miscibles lrsquoune aqueuse et lrsquoautre

constitueacutee par lrsquoeacutether qui est un solvant des lipidesil

se creacutee un coefficient de partage entre ces deux

phases et la reacutepartition de chaque eacuteleacutement feacutecal dans

chacune drsquoelles sera isoleacutes en fonction de son pouvoir

hydrophile ou lipophile

Bailenger a montreacute que le pH de la solution eacutetait

leacuteleacutement deacuteterminant pour la plus ou moins grande

efficaciteacute dune technique selon le parasite rechercheacute

Principes theacuteoriques

-Les selles tritureacutees (meacutelange au dixiegraveme environ) dans la solution choisie - elle peut ecirctre preacutealablement passeacutee sur un tamis pour eacuteliminer les gros deacutebris

le filtrat est verseacute dans un tube agrave centrifuger agrave fond conique en le remplissant 13

deacutether de maniegravere agrave ce quil y ai 23 du meacutelange selle en laissant 1 cm pour

fermer le tube

- Lrsquoagiter pendant une minute

- La suspension eacutetheacutero-liquide obtenue est centrifugeacutee agrave une vitesse lente de

lordre de 1500 agrave 2000 toursminute pendant une agrave trois minutes

- Apregraves centrifugation les constituants de la suspension sont reacutepartis en quatre

Couches

- Deacutecoller la couche des reacutesidus lipophiles agrave laide dune baguette de verre

- Retourner le tube au dessus de leacutevier (en faisant couler de leau) ou dun bac agrave

deacutechets liquides

- Essuyer les parois du tube avec un coton tenu agrave la pince en laissant toujours le

tube avec louverture dirigeacutee vers le bas pour eacuteviter de souiller le culot avec les

reacutesidus

- Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique pour

remettre en suspension le culot qui sera examineacute

- le culot qui nous inteacuteresse qui contient les eacuteleacutement parasitaires (kystes des

protozoaires)

Ether Debris

Phase aqueuse

Le culot

Les meacutethodes diphasiques sont

-Meacutethode de Telmann 1908

-Meacutethode De Rivas 1928

-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917

-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946

-Meacutethode De Ritchie 1948

-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood

-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf

-Meacutethode De Roman 1957

-Meacutethode de Bailenger 1962-1963

-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle

-Meacutethode de Junod 1927

Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage

Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia

Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)

La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble

lors de la centrifugation ce qui est un argument

diagnostique inteacuteressant

- Inconveacutenients

Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve

restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave

deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses

- Deacuteroulement de la technique

acide aceacutetique cristallisable 5 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethode de Bailenger - Avantages

Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et

des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5

(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)

- Inconveacutenients

Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre

technique est neacutecessaire

- Deacuteroulement de la technique

aceacutetate de sodium 15 g

acide aceacutetique 36 ml

eau distilleacutee qsp 1000 ml

Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide

dun pH-megravetre

Meacutethode de Ritchie simplifieacutee

- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles

formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour

enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les

oeufs dascaris et de schistosome

- Inconveacutenients

Le culot souvent volumineux est de lecture difficile

- Deacuteroulement de la technique

- Solutions de Ritchie

eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt

eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)

Meacutethode de Blagg et al

-Avantages

-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire

les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de

liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de

mercure souille les effluents du laboratoire

- Deacuteroulement de la technique

Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou

additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est

verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation

eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes

Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)

permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute

Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et

recommencer lagitation

On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et

cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee

Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages

-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles

Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes

aiseacutement et facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de

schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue

que les techniques en un temps

- Deacuteroulement de la technique

A) NaCl 9 g

formol officinal 10 ml

eau qsp 1000 ml

B) acide citrique 100 g

formol officinal 20 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethodes combineacutees

Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et

par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande

quantiteacute de selles

Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les

rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des

formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale

- Inconveacutenients

Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez

mal - Deacuteroulement de la technique

A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml

formol officinal 100 ml

eau qsp 1 000 ml

B bromure de sodium cristalliseacute 622 g

eau distilleacutee 1000 ml

Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant

pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou

kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour

trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente

- Inconveacutenients

Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps

assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate

preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)

- Deacuteroulement de la technique

- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)

liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml

eau distilleacutee 334 ml

Concentration diphasique

(MIF ou Bailenger)

une solution de

sulfate de zinc

30 secondes agrave f v

dilueacute au quart avec ED

Examiner

Le culot

Examiner

Le culot

iodomercurate

de potassium

de densiteacute 15

dilueacute au quart avec ED

Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod

simplifieacutee) - Avantages

donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete

- Inconveacutenients

Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi

dune solution de iodomercurate

- Deacuteroulement de la technique

Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)

- aceacutetate de sodium 15 g

- acide aceacutetique cristallisable 20 ml

- formol 40 ml

-eau qsp 1000 ml

Solution B (densiteacute 140)

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 442 volumes

8 g de selles

50 ml de solution de NaCl agrave

85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min

Suspension homo

+Tamisage Examiner

Le culot

eacuteliminer

le surnageant

20 ml dune solution A

+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique

1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min

4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer

le surnageant

Examiner

Le culot

Meacutethode de seacutedimentation-flottation

pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves

- Inconveacutenients

Quand la teneur des selles en lipides est anormalement

eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de

graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique

Solution de densiteacute 135

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 520 volumes

la suspension feacutecale en

eau agrave 85 de NaCl

1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min

1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min

20 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacute

eacuteliminer

le surnageant

5 agrave 7 ml de solution diodomercurate

de potassium de densiteacute 135 20 ml deau

Examen du culot

Seacutedimentation-flottation au saccharose

pour protozoaires - Avantages

permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les

kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand

lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste

na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des

selles fixeacutees au MIF

- Inconveacutenients

Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et

flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De

plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre

que des sels de mercure sont encore utiliseacutes

-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose

saccharose 120 g

eau 200 ml

Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et

utiliser alors

saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml

Suspension homo

+Tamisage +

2 agrave 3 heures

50 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacutee

fraicircche

10 agrave 15 ml de la suspension

1800-2000 toursmin 90sec

rejeter le surnageant

L 1 en12humide

3 agrave 4 g de selles

Seacute

dim

en

tatio

n

8 agrave 10 ml de solution de saccharose

+ 05 ml de solution de chlorure

mercurique agrave 15 en ED

1000 toursmin 45 sec

deacutecanter le

surnageant

dans T2

L 2 en12humide

Flottation

T2 20 agrave 30 ml deau

2000 toursmin90 sec

L 3 en12humide

Preacutecipitation

Les colorations

utile en cas de doute lrsquoidentification des

kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces

des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires

coloreacutees

recommandeacutee pour la conservation de

mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre

laboratoire pour avis

indispensable pour le diagnostic de certains

parasites (Cryptosporides microsporides)

Meacutethodes de coloration rapides

(Colorations en tubes)

- Meacutethode de Bailenger et Faraggi

- Meacutethode de Sapro Lawless et

Strome

-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene

tamporeacute

-Meacutethode de Horkin

- Meacutethode de Sargeaut

-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero

Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de

Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-

formol Apregraves meacutelange

- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave

laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout

-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le

fond du tube

-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en

protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees

immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine

des noyaux est coloreacutee en brun par liode

Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent

donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol

sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement

leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes

- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou

directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension

de selles avec le colorant

Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des

protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux

apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs

jours

la coloration de Bailenger

Laisser pendant une nuit en contact

cristal violet 2 g

fuchsine basique 005 g

alcool agrave 95deg 20 ml

pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml

eau distilleacutee 100 ml

Coloration des frottis

Pour bien observer les structures nucleacuteaires et

garder des lames de reacutefeacuterence on

confectionne un frottis de selles humide et

eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en

- 3 temps fixation puis coloration puis

diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)

- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg

Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)

Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag

- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher

soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains

dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)

soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)

soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1

heure)

-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode

-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau

- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3

30 min agrave leacutetuve agrave 37deg

- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece

24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs

-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au

microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent

nettement

-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau

-Deacuteshydrater

-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est

poseacutee deacutefinitivement

- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les

trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure

des noyaux Les kystes apparaissent en bleu

pacircle avec des noyaux bien nets Cest une

technique facile agrave reacutealiser

- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible

- Plonger la lame dans le fixateur colorant de

Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures

- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au

baume de Canada ou au baume syntheacutetique

Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par

Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie

- Seacutechage

- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol

- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid

- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet

- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20

secondes en agitant

- Rinccedilage

-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5

- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100

- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert

Coloration des microscporidies

Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10

- Effectuer un frottis de la selle

- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de

meacutethanol

- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes

- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord

en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml

- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge

Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee

microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-

Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution

- Colorer pendant 3 heures

- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02

-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-

Rincer seacutecher et lire au grossissement x100

Coloration par Uvitex 2B

Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute

pour la chitine Met en eacutevidence les

microsporidie par une fluorescence

directe On obtient une

fluorescence bleue pale sur fond

noir

Scotch test anal ( test de Graham agrave

la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius

vermicularis ainsi que les anneaux ou les

oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors

de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est

appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant

toute toilette en position foetale ou genou

pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus

et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute

sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera

agrave lrsquoobjectif X10

NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les

parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que

la technique devra ecirctre faite avec des gants

ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite

pour eacuteviter la contamination par les oeufs

auto-infestant de lrsquooxyure

Meacutethodes speacuteciales

Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon

eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs

drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle

de la taille drsquoun petit pois

Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen

des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm

dans une quantiteacute de vert malachite agrave

3 (contre colorant) et de glyceacuterine

appliquer la bande sur la selle et sur la

lame renverser et appuyer sur la

paillasse

Methode de Kato-Katz quantitative

utilise un gabarie pour la selle

Meacutethode efficace pour la recherche

doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale

mais inutilisable pour les kytes et les

larves ainsi que les oeufs dankylostome

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

Seacutecuriteacute au laboratoire (principes geacuteneacuteraux)

-un manuel des consignes de seacutecuriteacute au

laboratoire

-trousse de secours

-vecirctements protecteurs

-nettoyer les paillasses (deacutetergent et

deacutesinfectent les surfaces)

-se laver les mains

-manipulation des preacutelegravevements exige des

preacutecautions particuliegraveres surtouts en cas des

preacutelegravevement de sang (potentiellement

infectieux)

-eacutelimination des lames porte-objets

Entretien du microscope

Ce que vous devez faire

Etalonnage du microscope

taille est un critegravere important

(kyste et œufs)

cellule heacutematimegravetrique

un micromegravetre oculaire

LA COPROLOGIE

PARASITAIRE

Chapitre 1 Premiegraveres observations des parasites

La coprologie parasitaire ou lrsquoexamen parasitologique des

selles EPS met en eacutevidence et identifie

Les parasites vivants dans le tube digestif Ex Protozoaires et

helminthes (Ascaris lumbricoides tronguiloides stercoralis)

Les parasites pour les quelles les selles sont un moyen drsquoeacutelimination de

leur forme de disseacutemination dans le milieu exteacuterieur Ex Schistosoma mansoni

(vit dans le plexus veineux)

LrsquoEPS mettra en eacutevidence

- une partie du parasite Ex Anneaux deTaenia saginata qui se deacutetachent en

dehors des selles

- une forme eacutevolutive du parasite (larve et oeuf drsquohelminthe) Ex oeuf

drsquoAncylostoma duodenalis

- la forme deacutefinitive du parasite Ex adulte drsquohelminthe Strongyloides stercoralis

les formes veacutegeacutetatives des amibes et des flagelleacutes sont

fragiles dans le milieu exteacuterieur

Preacuteparation du malade

Reacutegime alimentaire limiteacute avant de faire lrsquoexamen Eacuteviter de consommer Les fruits agrave cuticule dure (poires

pommes) Feacuteculents et graines agrave enveloppes segraveches

(lentillefegraveves) Foie drsquoovins ou de bovins

Arrecircter des meacutedicaments - Les antiseptiques intestinaux

- Les antibiotiques et les sulfamides

- Les laxatifs tels que le bismuth le charbon lhuile de paraffine

les suppositoires

--Ne pas faire de radiologie digestive utilisant des produits de

contraste comme la baryte

Fiche clinique

acircge sexe adresse animaux de compagnie profession

(veacuteteacuterinaire agriculteur) habitudes alimentaires statut

immunitaire

PRELEVEMENT

Nombre de preacutelegravevements

Une seul analyse ne permet de deacuteceler la preacutesense

drsquoeacuteleacutements parasitaires que dans 30 des cas

- Rareteacute des eacuteleacutements parasitaires

- Efficaciteacute des techniques utiliseacutees

-Une peacuteriode muette de rejet des eacutelements

caracteacuteristiques (giardiase amibiase)

Il faut dans lrsquoideal pratiquer trois

examens coprologiques agrave quelques

jours drsquointervalle pour affirmer la

neacutegativiteacute

Recueil des selles

-Reacutecipient propre et sec agrave bouchage hermeacutetique

-faire recueillir lrsquoensemble de lrsquoeacutemission

-etiquetage prescripteur nom du patient date

du preacutelegravevement et traitement observeacute si il existe

- les selles ne doit surtout pas ecirctre meacutelanger aux

urines (destruction des formes veacutegeacutetatives)

Deacutelai drsquoexamen

Il faut que la selle parvienne dans les plus brefs deacutelais au

laboratoire afin drsquoeacuteviter la deacutegeacuteneacuterescence des formes

veacutegeacutetatives des protozoaires qui sont sensible agrave la variation

de tempeacuteratures et agrave la deacuteshydratation

Techniques de conservation

Conservation provisoire par le froid (+4degC)

-Bonne conservation des kystes de protozoaires etou

œufs drsquohelminthes

-Mort rapide des trophozoites de protozoaire

-Mort les larves drsquoanguilules

Meacutethode agrave lrsquoeau formoleacutee ( fixation conservation)

-Aldehyde formique( formol) de 5 agrave 20

-Glyceacuterine( facultatif)

-Eau distilleacutee ou lrsquoeau physiologique 100ml La selle +

3 vol 1 vol

tamiser Sedimenter stoker

Bonne conservation œufs drsquohelminthe et kystes de

protozoaires tant que le preacutelegravevement reste liquide

Fixation au MIF (Merthiolate-Iode-Formol)

SOLUTION 1 de mercurothiolate iode

ndashformol

-teinture de mercurethiolate 200 ml

-glycerine 5 ml

-formol agrave 40 25 ml

-eau distilleacutee 250 ml

SOLUTION 2 de Lugol

-iode 05 g

-iode de potassium 1g

-eau distilleacutee 10 ml

1175 ml 075ml +

3 agrave 5 g selles

Triturer stoker

Conservation beaucoups plus longue des

formes veacutegeacutetatives et les kystes de protozoaires

Meacutelange fixateur agrave lrsquoalcool polyvinylique APV

APV

-alcool polyvinylique en poudre

5g

-glyceacuterol 15ml

-eau distilleacutee 625 ml

un bain marie ( 70 -75degC)10mn

Fixateur de Schaudinn modifieacute

-cristaux de clorure de mercure HgCl2

15g

-ethanol agrave 95 31 ml

Acide aceacutetique glacial 5ml +

2 agrave 3 mn

-Bonne conservation

-Une fixtion permettant de pratiquer des

frottis pouvant etre coloreacutes

Concervation des vers

Neacutematotes

Treacutematodes

cestodes

+ eau physiologique Entre 2 lames

Plongeacutes dan un fixteur

Ex - alcool 70 bouillant

- meacutelange alcool et formol

Aspect normal de la selle - poids de 110 agrave 150 g

- couleur brune

- Une consistance ferme et un aspect mouleacute

-- Un pH drsquoenviron 7

Microscopiquement en doit observeacute

-- Des fibres musculaires

-- De la cellulose non digestible poils vaisseaux

ligneux eacuteleacutements scleacutereux

-- de lrsquoamidon si le reacutegime est riche en feacuteculents et chez

lrsquoenfant

-- Quelques masses amorphes ou disques radieacutes ( les

savons)

-- il ne doit pas avoir de globules gras ( graisses

neutres)

COPROLOGIE PARASITAIRE Conduite de lrsquoexamen

1048766 Examen macroscopique

1048766 Examen microscopique

- Examen direct sans concentration

- Examen direct apreacutes concentration

- Les meacutethodes physiques

- Techniques de flottation

- Techniques de seacutedimentation

- Les meacutethodes physico-chimiques

- Les meacutethodes combineacutees

-Colorations speacutecifiques

- cultures

- Examens particuliers

Lrsquoobservation macroscopique Il permet de noter

- Couleur ( brune jaune ou ocre verte

deacutecoloreacutee noire rouge)

- consistance (molle dure liquide)

- aspect (preacutesence de bulles ou de gras

steacuteatorrheacutee)

- Preacutesence drsquoeacuteleacutements surajouteacutes

-Parasites adulte drsquoAscaris femelle drsquooxuyre

anneau ou chaine de taenia

-glaire (mucus)

-sang de pus

Lrsquoexamen direct sans concentration -Lexamen direct est le seule examen qui permet drsquoappreacutecier la vitaliteacute des

parasites

-Il met en eacutevidence les kystes et les formes veacutegeacutetatives de protozoaires ainsi

quelques oeufs et les larves dhelminthes

- On peut rajouter du Lugol double sur la lame qui fixe et colore les

structure nucleacuteaires

- Quelque soit le reacutesultat de lrsquoexamen direct on doit obligatoirement le

compleacuteter par deux techniques de concentration lrsquoune pour les kystes et

lrsquoautre pour les oeufs

- Il est impeacuteratif de connaitre la deacutescription des eacuteleacutements parasitaire et

de retenir les possibles faux parasites

Lrsquoobservation microscopique

une noisette de selle

(agrave diffeacuterents endroits)

lrsquoeau physiologique

agrave 09

suspension homogegravene

2 gouttes sur une

lame recouvrir par

une lamelle

lecture en

zig-zag x10

x 40

+

Les meacutethodes de concentrations

Les techniques par lesquelles on

essaie agrave partir de la grande quantiteacute

de la matieres feacutecales recueillies

drsquoobtenir dans un faible volume les

œufs larves kystes voire formes

veacutegeacutetatifs fixeacutees de parasites par

eacutelimination des reacutesidus de la

digestion

Les meacutethodes physiques

Les selles dilueacutees dans un reacuteactif de densiteacute

diffeacuterente de celle de parasite

DR superieur DP = flottation

DR inferieur DP = seacutedimentation

A-Techniques de flottation

Crsquoest une technique part du principe que la densiteacute du liquide et supeacuterieur

agrave celle des parasites ces derniers plus leacutegers flottent agrave la surface

Les principales techniques de flottation

- Meacutethode de Fullborn (1920) elle utilise une solution satureacutee de NaCl

(NaCl 250g ED 750ml d=12)

- Meacutethode de Willis (1921) simple et utilisable en routine

bullDiluer une noisette de selle dans la solution satureacutee de NaCl agrave 25

bullRemplissez un tube en verre conique jusquagrave sonbord en formant un

meacutenisque concave (verre de montre) sur lequel on deacutepose une lamelle

pendant 15 minutes (pas plus pour eacuteviter la cristalisation des oeufs) On la

deacutepose ensuite sur une lame porte objet et on observe agrave lrsquoobjectif X10 agrave la

recherche des OEufs drsquohelminthes tels que ceux drsquoHymenolepis ou

drsquoAnkylstomes

-Meacutethode de Janeckso et Urbanyi(1931) utilise comme reacuteactif une

solution de domercurate de potassium ( d=114) qui doit etre manipuleacutee

avec prudence

Iodo-mercurate de potassium

Bi iodure de mercure 100g

Iodure de potassium 74g

Eau distilleacutee 50 ml

-Meacutethode de Faust (1938) on centrifuge agrave 1500 tm une dilution des

selles dans lrsquoeau ordinaire tieacutede et on rejette le surnageant et on remet le

culot en suspension dans drsquoeau On reacutepegravete lrsquoopeacuteration jusqursquoagrave ce que le

surnageant soit limpide on remet alors le culot en suspension dans le

sulfate de Zink agrave 33 Apreacutes centrifugation on preacutelegraveve agrave lrsquoanse de

platine la pellicule de surfase qursquoon examine au microscope

- Meacutethode drsquoOtto Hwitt et Straham (1941) on procegravede de la meme

maniere que pour le Willis mais avec une solution aqueuse de sulfate

de Zink agrave 33 D=118

Avantage -Technique simple

-Mateacuteriel rudimentaire

- reacutealisation en seacuterie

-Sensibiliteacute treacutes bonne++++

Inconveacutenient

-Elle a ce pendant lrsquoinconveacutenient drsquoalteacuterer des Larves et les

Kystes pour les quels elle est contre-indiqueacutee ( reactifs

hypertoniques) de mecircme que pour les selles liquides ou

riches en lipides

-Elle donne de bons reacutesultats pour les oeufs drsquohelminthes

leacutegers (oeufs drsquoHymenolepis drsquoAnkylostome et deTaelignia)

B-Techniques de seacutedimentation bullLe diluant a une densiteacute inferieure agrave celle du

parasite alors se dernier se seacutedimente

Les principales techniques

- Meacutethode par seacutedimentation simple

- Meacutethode de Faust et IngallsReacutealiseacutee en utilisant

lrsquoeau glyceacuterineacutee (Eau + Glyceacuterine agrave 05) elle

permet drsquoaugmenter la mouillabiliteacute qui facilite la

seacutedimentation des parasites larves Anguillules

Œufs drsquoAscaris non feacutecondeacutes et œufs de

Schistosoma mansoni

-Meacutethode de Baroody et MostSeacutedimentation

centrifugation Eau de robinet chauffeacutee agrave 42degC

- Meacutethode de Jahnes et Hodges

Avantage -Technique simple

-Mateacuteriel rudimentaire

- reacutealisation en seacuterie

- Traitent une grande masse feacutecale ( parasites rares ou irreacuteguliegraverere ment

repartis dans la selle)

Inconveacutenient -une technique longue agrave reacutealiser

-Les cellules veacutegeacutetales seacutedimentent aussi vite que les parasites (Preacutesence

de certains reacutesidus)

-Non indiqueacutes en routine (sensibiliteacute

moyenne++)

Meacutethodes physico-chimiques ou

Diphasiques Caracteacuteriseacutees par la mise en preacutesence de deux

phases non miscibles lrsquoune aqueuse et lrsquoautre

constitueacutee par lrsquoeacutether qui est un solvant des lipidesil

se creacutee un coefficient de partage entre ces deux

phases et la reacutepartition de chaque eacuteleacutement feacutecal dans

chacune drsquoelles sera isoleacutes en fonction de son pouvoir

hydrophile ou lipophile

Bailenger a montreacute que le pH de la solution eacutetait

leacuteleacutement deacuteterminant pour la plus ou moins grande

efficaciteacute dune technique selon le parasite rechercheacute

Principes theacuteoriques

-Les selles tritureacutees (meacutelange au dixiegraveme environ) dans la solution choisie - elle peut ecirctre preacutealablement passeacutee sur un tamis pour eacuteliminer les gros deacutebris

le filtrat est verseacute dans un tube agrave centrifuger agrave fond conique en le remplissant 13

deacutether de maniegravere agrave ce quil y ai 23 du meacutelange selle en laissant 1 cm pour

fermer le tube

- Lrsquoagiter pendant une minute

- La suspension eacutetheacutero-liquide obtenue est centrifugeacutee agrave une vitesse lente de

lordre de 1500 agrave 2000 toursminute pendant une agrave trois minutes

- Apregraves centrifugation les constituants de la suspension sont reacutepartis en quatre

Couches

- Deacutecoller la couche des reacutesidus lipophiles agrave laide dune baguette de verre

- Retourner le tube au dessus de leacutevier (en faisant couler de leau) ou dun bac agrave

deacutechets liquides

- Essuyer les parois du tube avec un coton tenu agrave la pince en laissant toujours le

tube avec louverture dirigeacutee vers le bas pour eacuteviter de souiller le culot avec les

reacutesidus

- Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique pour

remettre en suspension le culot qui sera examineacute

- le culot qui nous inteacuteresse qui contient les eacuteleacutement parasitaires (kystes des

protozoaires)

Ether Debris

Phase aqueuse

Le culot

Les meacutethodes diphasiques sont

-Meacutethode de Telmann 1908

-Meacutethode De Rivas 1928

-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917

-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946

-Meacutethode De Ritchie 1948

-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood

-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf

-Meacutethode De Roman 1957

-Meacutethode de Bailenger 1962-1963

-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle

-Meacutethode de Junod 1927

Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage

Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia

Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)

La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble

lors de la centrifugation ce qui est un argument

diagnostique inteacuteressant

- Inconveacutenients

Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve

restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave

deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses

- Deacuteroulement de la technique

acide aceacutetique cristallisable 5 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethode de Bailenger - Avantages

Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et

des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5

(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)

- Inconveacutenients

Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre

technique est neacutecessaire

- Deacuteroulement de la technique

aceacutetate de sodium 15 g

acide aceacutetique 36 ml

eau distilleacutee qsp 1000 ml

Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide

dun pH-megravetre

Meacutethode de Ritchie simplifieacutee

- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles

formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour

enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les

oeufs dascaris et de schistosome

- Inconveacutenients

Le culot souvent volumineux est de lecture difficile

- Deacuteroulement de la technique

- Solutions de Ritchie

eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt

eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)

Meacutethode de Blagg et al

-Avantages

-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire

les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de

liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de

mercure souille les effluents du laboratoire

- Deacuteroulement de la technique

Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou

additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est

verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation

eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes

Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)

permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute

Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et

recommencer lagitation

On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et

cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee

Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages

-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles

Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes

aiseacutement et facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de

schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue

que les techniques en un temps

- Deacuteroulement de la technique

A) NaCl 9 g

formol officinal 10 ml

eau qsp 1000 ml

B) acide citrique 100 g

formol officinal 20 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethodes combineacutees

Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et

par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande

quantiteacute de selles

Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les

rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des

formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale

- Inconveacutenients

Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez

mal - Deacuteroulement de la technique

A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml

formol officinal 100 ml

eau qsp 1 000 ml

B bromure de sodium cristalliseacute 622 g

eau distilleacutee 1000 ml

Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant

pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou

kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour

trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente

- Inconveacutenients

Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps

assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate

preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)

- Deacuteroulement de la technique

- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)

liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml

eau distilleacutee 334 ml

Concentration diphasique

(MIF ou Bailenger)

une solution de

sulfate de zinc

30 secondes agrave f v

dilueacute au quart avec ED

Examiner

Le culot

Examiner

Le culot

iodomercurate

de potassium

de densiteacute 15

dilueacute au quart avec ED

Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod

simplifieacutee) - Avantages

donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete

- Inconveacutenients

Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi

dune solution de iodomercurate

- Deacuteroulement de la technique

Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)

- aceacutetate de sodium 15 g

- acide aceacutetique cristallisable 20 ml

- formol 40 ml

-eau qsp 1000 ml

Solution B (densiteacute 140)

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 442 volumes

8 g de selles

50 ml de solution de NaCl agrave

85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min

Suspension homo

+Tamisage Examiner

Le culot

eacuteliminer

le surnageant

20 ml dune solution A

+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique

1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min

4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer

le surnageant

Examiner

Le culot

Meacutethode de seacutedimentation-flottation

pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves

- Inconveacutenients

Quand la teneur des selles en lipides est anormalement

eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de

graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique

Solution de densiteacute 135

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 520 volumes

la suspension feacutecale en

eau agrave 85 de NaCl

1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min

1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min

20 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacute

eacuteliminer

le surnageant

5 agrave 7 ml de solution diodomercurate

de potassium de densiteacute 135 20 ml deau

Examen du culot

Seacutedimentation-flottation au saccharose

pour protozoaires - Avantages

permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les

kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand

lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste

na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des

selles fixeacutees au MIF

- Inconveacutenients

Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et

flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De

plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre

que des sels de mercure sont encore utiliseacutes

-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose

saccharose 120 g

eau 200 ml

Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et

utiliser alors

saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml

Suspension homo

+Tamisage +

2 agrave 3 heures

50 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacutee

fraicircche

10 agrave 15 ml de la suspension

1800-2000 toursmin 90sec

rejeter le surnageant

L 1 en12humide

3 agrave 4 g de selles

Seacute

dim

en

tatio

n

8 agrave 10 ml de solution de saccharose

+ 05 ml de solution de chlorure

mercurique agrave 15 en ED

1000 toursmin 45 sec

deacutecanter le

surnageant

dans T2

L 2 en12humide

Flottation

T2 20 agrave 30 ml deau

2000 toursmin90 sec

L 3 en12humide

Preacutecipitation

Les colorations

utile en cas de doute lrsquoidentification des

kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces

des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires

coloreacutees

recommandeacutee pour la conservation de

mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre

laboratoire pour avis

indispensable pour le diagnostic de certains

parasites (Cryptosporides microsporides)

Meacutethodes de coloration rapides

(Colorations en tubes)

- Meacutethode de Bailenger et Faraggi

- Meacutethode de Sapro Lawless et

Strome

-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene

tamporeacute

-Meacutethode de Horkin

- Meacutethode de Sargeaut

-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero

Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de

Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-

formol Apregraves meacutelange

- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave

laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout

-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le

fond du tube

-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en

protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees

immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine

des noyaux est coloreacutee en brun par liode

Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent

donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol

sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement

leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes

- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou

directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension

de selles avec le colorant

Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des

protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux

apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs

jours

la coloration de Bailenger

Laisser pendant une nuit en contact

cristal violet 2 g

fuchsine basique 005 g

alcool agrave 95deg 20 ml

pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml

eau distilleacutee 100 ml

Coloration des frottis

Pour bien observer les structures nucleacuteaires et

garder des lames de reacutefeacuterence on

confectionne un frottis de selles humide et

eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en

- 3 temps fixation puis coloration puis

diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)

- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg

Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)

Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag

- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher

soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains

dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)

soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)

soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1

heure)

-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode

-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau

- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3

30 min agrave leacutetuve agrave 37deg

- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece

24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs

-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au

microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent

nettement

-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau

-Deacuteshydrater

-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est

poseacutee deacutefinitivement

- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les

trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure

des noyaux Les kystes apparaissent en bleu

pacircle avec des noyaux bien nets Cest une

technique facile agrave reacutealiser

- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible

- Plonger la lame dans le fixateur colorant de

Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures

- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au

baume de Canada ou au baume syntheacutetique

Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par

Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie

- Seacutechage

- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol

- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid

- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet

- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20

secondes en agitant

- Rinccedilage

-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5

- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100

- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert

Coloration des microscporidies

Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10

- Effectuer un frottis de la selle

- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de

meacutethanol

- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes

- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord

en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml

- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge

Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee

microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-

Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution

- Colorer pendant 3 heures

- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02

-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-

Rincer seacutecher et lire au grossissement x100

Coloration par Uvitex 2B

Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute

pour la chitine Met en eacutevidence les

microsporidie par une fluorescence

directe On obtient une

fluorescence bleue pale sur fond

noir

Scotch test anal ( test de Graham agrave

la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius

vermicularis ainsi que les anneaux ou les

oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors

de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est

appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant

toute toilette en position foetale ou genou

pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus

et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute

sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera

agrave lrsquoobjectif X10

NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les

parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que

la technique devra ecirctre faite avec des gants

ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite

pour eacuteviter la contamination par les oeufs

auto-infestant de lrsquooxyure

Meacutethodes speacuteciales

Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon

eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs

drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle

de la taille drsquoun petit pois

Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen

des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm

dans une quantiteacute de vert malachite agrave

3 (contre colorant) et de glyceacuterine

appliquer la bande sur la selle et sur la

lame renverser et appuyer sur la

paillasse

Methode de Kato-Katz quantitative

utilise un gabarie pour la selle

Meacutethode efficace pour la recherche

doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale

mais inutilisable pour les kytes et les

larves ainsi que les oeufs dankylostome

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

Entretien du microscope

Ce que vous devez faire

Etalonnage du microscope

taille est un critegravere important

(kyste et œufs)

cellule heacutematimegravetrique

un micromegravetre oculaire

LA COPROLOGIE

PARASITAIRE

Chapitre 1 Premiegraveres observations des parasites

La coprologie parasitaire ou lrsquoexamen parasitologique des

selles EPS met en eacutevidence et identifie

Les parasites vivants dans le tube digestif Ex Protozoaires et

helminthes (Ascaris lumbricoides tronguiloides stercoralis)

Les parasites pour les quelles les selles sont un moyen drsquoeacutelimination de

leur forme de disseacutemination dans le milieu exteacuterieur Ex Schistosoma mansoni

(vit dans le plexus veineux)

LrsquoEPS mettra en eacutevidence

- une partie du parasite Ex Anneaux deTaenia saginata qui se deacutetachent en

dehors des selles

- une forme eacutevolutive du parasite (larve et oeuf drsquohelminthe) Ex oeuf

drsquoAncylostoma duodenalis

- la forme deacutefinitive du parasite Ex adulte drsquohelminthe Strongyloides stercoralis

les formes veacutegeacutetatives des amibes et des flagelleacutes sont

fragiles dans le milieu exteacuterieur

Preacuteparation du malade

Reacutegime alimentaire limiteacute avant de faire lrsquoexamen Eacuteviter de consommer Les fruits agrave cuticule dure (poires

pommes) Feacuteculents et graines agrave enveloppes segraveches

(lentillefegraveves) Foie drsquoovins ou de bovins

Arrecircter des meacutedicaments - Les antiseptiques intestinaux

- Les antibiotiques et les sulfamides

- Les laxatifs tels que le bismuth le charbon lhuile de paraffine

les suppositoires

--Ne pas faire de radiologie digestive utilisant des produits de

contraste comme la baryte

Fiche clinique

acircge sexe adresse animaux de compagnie profession

(veacuteteacuterinaire agriculteur) habitudes alimentaires statut

immunitaire

PRELEVEMENT

Nombre de preacutelegravevements

Une seul analyse ne permet de deacuteceler la preacutesense

drsquoeacuteleacutements parasitaires que dans 30 des cas

- Rareteacute des eacuteleacutements parasitaires

- Efficaciteacute des techniques utiliseacutees

-Une peacuteriode muette de rejet des eacutelements

caracteacuteristiques (giardiase amibiase)

Il faut dans lrsquoideal pratiquer trois

examens coprologiques agrave quelques

jours drsquointervalle pour affirmer la

neacutegativiteacute

Recueil des selles

-Reacutecipient propre et sec agrave bouchage hermeacutetique

-faire recueillir lrsquoensemble de lrsquoeacutemission

-etiquetage prescripteur nom du patient date

du preacutelegravevement et traitement observeacute si il existe

- les selles ne doit surtout pas ecirctre meacutelanger aux

urines (destruction des formes veacutegeacutetatives)

Deacutelai drsquoexamen

Il faut que la selle parvienne dans les plus brefs deacutelais au

laboratoire afin drsquoeacuteviter la deacutegeacuteneacuterescence des formes

veacutegeacutetatives des protozoaires qui sont sensible agrave la variation

de tempeacuteratures et agrave la deacuteshydratation

Techniques de conservation

Conservation provisoire par le froid (+4degC)

-Bonne conservation des kystes de protozoaires etou

œufs drsquohelminthes

-Mort rapide des trophozoites de protozoaire

-Mort les larves drsquoanguilules

Meacutethode agrave lrsquoeau formoleacutee ( fixation conservation)

-Aldehyde formique( formol) de 5 agrave 20

-Glyceacuterine( facultatif)

-Eau distilleacutee ou lrsquoeau physiologique 100ml La selle +

3 vol 1 vol

tamiser Sedimenter stoker

Bonne conservation œufs drsquohelminthe et kystes de

protozoaires tant que le preacutelegravevement reste liquide

Fixation au MIF (Merthiolate-Iode-Formol)

SOLUTION 1 de mercurothiolate iode

ndashformol

-teinture de mercurethiolate 200 ml

-glycerine 5 ml

-formol agrave 40 25 ml

-eau distilleacutee 250 ml

SOLUTION 2 de Lugol

-iode 05 g

-iode de potassium 1g

-eau distilleacutee 10 ml

1175 ml 075ml +

3 agrave 5 g selles

Triturer stoker

Conservation beaucoups plus longue des

formes veacutegeacutetatives et les kystes de protozoaires

Meacutelange fixateur agrave lrsquoalcool polyvinylique APV

APV

-alcool polyvinylique en poudre

5g

-glyceacuterol 15ml

-eau distilleacutee 625 ml

un bain marie ( 70 -75degC)10mn

Fixateur de Schaudinn modifieacute

-cristaux de clorure de mercure HgCl2

15g

-ethanol agrave 95 31 ml

Acide aceacutetique glacial 5ml +

2 agrave 3 mn

-Bonne conservation

-Une fixtion permettant de pratiquer des

frottis pouvant etre coloreacutes

Concervation des vers

Neacutematotes

Treacutematodes

cestodes

+ eau physiologique Entre 2 lames

Plongeacutes dan un fixteur

Ex - alcool 70 bouillant

- meacutelange alcool et formol

Aspect normal de la selle - poids de 110 agrave 150 g

- couleur brune

- Une consistance ferme et un aspect mouleacute

-- Un pH drsquoenviron 7

Microscopiquement en doit observeacute

-- Des fibres musculaires

-- De la cellulose non digestible poils vaisseaux

ligneux eacuteleacutements scleacutereux

-- de lrsquoamidon si le reacutegime est riche en feacuteculents et chez

lrsquoenfant

-- Quelques masses amorphes ou disques radieacutes ( les

savons)

-- il ne doit pas avoir de globules gras ( graisses

neutres)

COPROLOGIE PARASITAIRE Conduite de lrsquoexamen

1048766 Examen macroscopique

1048766 Examen microscopique

- Examen direct sans concentration

- Examen direct apreacutes concentration

- Les meacutethodes physiques

- Techniques de flottation

- Techniques de seacutedimentation

- Les meacutethodes physico-chimiques

- Les meacutethodes combineacutees

-Colorations speacutecifiques

- cultures

- Examens particuliers

Lrsquoobservation macroscopique Il permet de noter

- Couleur ( brune jaune ou ocre verte

deacutecoloreacutee noire rouge)

- consistance (molle dure liquide)

- aspect (preacutesence de bulles ou de gras

steacuteatorrheacutee)

- Preacutesence drsquoeacuteleacutements surajouteacutes

-Parasites adulte drsquoAscaris femelle drsquooxuyre

anneau ou chaine de taenia

-glaire (mucus)

-sang de pus

Lrsquoexamen direct sans concentration -Lexamen direct est le seule examen qui permet drsquoappreacutecier la vitaliteacute des

parasites

-Il met en eacutevidence les kystes et les formes veacutegeacutetatives de protozoaires ainsi

quelques oeufs et les larves dhelminthes

- On peut rajouter du Lugol double sur la lame qui fixe et colore les

structure nucleacuteaires

- Quelque soit le reacutesultat de lrsquoexamen direct on doit obligatoirement le

compleacuteter par deux techniques de concentration lrsquoune pour les kystes et

lrsquoautre pour les oeufs

- Il est impeacuteratif de connaitre la deacutescription des eacuteleacutements parasitaire et

de retenir les possibles faux parasites

Lrsquoobservation microscopique

une noisette de selle

(agrave diffeacuterents endroits)

lrsquoeau physiologique

agrave 09

suspension homogegravene

2 gouttes sur une

lame recouvrir par

une lamelle

lecture en

zig-zag x10

x 40

+

Les meacutethodes de concentrations

Les techniques par lesquelles on

essaie agrave partir de la grande quantiteacute

de la matieres feacutecales recueillies

drsquoobtenir dans un faible volume les

œufs larves kystes voire formes

veacutegeacutetatifs fixeacutees de parasites par

eacutelimination des reacutesidus de la

digestion

Les meacutethodes physiques

Les selles dilueacutees dans un reacuteactif de densiteacute

diffeacuterente de celle de parasite

DR superieur DP = flottation

DR inferieur DP = seacutedimentation

A-Techniques de flottation

Crsquoest une technique part du principe que la densiteacute du liquide et supeacuterieur

agrave celle des parasites ces derniers plus leacutegers flottent agrave la surface

Les principales techniques de flottation

- Meacutethode de Fullborn (1920) elle utilise une solution satureacutee de NaCl

(NaCl 250g ED 750ml d=12)

- Meacutethode de Willis (1921) simple et utilisable en routine

bullDiluer une noisette de selle dans la solution satureacutee de NaCl agrave 25

bullRemplissez un tube en verre conique jusquagrave sonbord en formant un

meacutenisque concave (verre de montre) sur lequel on deacutepose une lamelle

pendant 15 minutes (pas plus pour eacuteviter la cristalisation des oeufs) On la

deacutepose ensuite sur une lame porte objet et on observe agrave lrsquoobjectif X10 agrave la

recherche des OEufs drsquohelminthes tels que ceux drsquoHymenolepis ou

drsquoAnkylstomes

-Meacutethode de Janeckso et Urbanyi(1931) utilise comme reacuteactif une

solution de domercurate de potassium ( d=114) qui doit etre manipuleacutee

avec prudence

Iodo-mercurate de potassium

Bi iodure de mercure 100g

Iodure de potassium 74g

Eau distilleacutee 50 ml

-Meacutethode de Faust (1938) on centrifuge agrave 1500 tm une dilution des

selles dans lrsquoeau ordinaire tieacutede et on rejette le surnageant et on remet le

culot en suspension dans drsquoeau On reacutepegravete lrsquoopeacuteration jusqursquoagrave ce que le

surnageant soit limpide on remet alors le culot en suspension dans le

sulfate de Zink agrave 33 Apreacutes centrifugation on preacutelegraveve agrave lrsquoanse de

platine la pellicule de surfase qursquoon examine au microscope

- Meacutethode drsquoOtto Hwitt et Straham (1941) on procegravede de la meme

maniere que pour le Willis mais avec une solution aqueuse de sulfate

de Zink agrave 33 D=118

Avantage -Technique simple

-Mateacuteriel rudimentaire

- reacutealisation en seacuterie

-Sensibiliteacute treacutes bonne++++

Inconveacutenient

-Elle a ce pendant lrsquoinconveacutenient drsquoalteacuterer des Larves et les

Kystes pour les quels elle est contre-indiqueacutee ( reactifs

hypertoniques) de mecircme que pour les selles liquides ou

riches en lipides

-Elle donne de bons reacutesultats pour les oeufs drsquohelminthes

leacutegers (oeufs drsquoHymenolepis drsquoAnkylostome et deTaelignia)

B-Techniques de seacutedimentation bullLe diluant a une densiteacute inferieure agrave celle du

parasite alors se dernier se seacutedimente

Les principales techniques

- Meacutethode par seacutedimentation simple

- Meacutethode de Faust et IngallsReacutealiseacutee en utilisant

lrsquoeau glyceacuterineacutee (Eau + Glyceacuterine agrave 05) elle

permet drsquoaugmenter la mouillabiliteacute qui facilite la

seacutedimentation des parasites larves Anguillules

Œufs drsquoAscaris non feacutecondeacutes et œufs de

Schistosoma mansoni

-Meacutethode de Baroody et MostSeacutedimentation

centrifugation Eau de robinet chauffeacutee agrave 42degC

- Meacutethode de Jahnes et Hodges

Avantage -Technique simple

-Mateacuteriel rudimentaire

- reacutealisation en seacuterie

- Traitent une grande masse feacutecale ( parasites rares ou irreacuteguliegraverere ment

repartis dans la selle)

Inconveacutenient -une technique longue agrave reacutealiser

-Les cellules veacutegeacutetales seacutedimentent aussi vite que les parasites (Preacutesence

de certains reacutesidus)

-Non indiqueacutes en routine (sensibiliteacute

moyenne++)

Meacutethodes physico-chimiques ou

Diphasiques Caracteacuteriseacutees par la mise en preacutesence de deux

phases non miscibles lrsquoune aqueuse et lrsquoautre

constitueacutee par lrsquoeacutether qui est un solvant des lipidesil

se creacutee un coefficient de partage entre ces deux

phases et la reacutepartition de chaque eacuteleacutement feacutecal dans

chacune drsquoelles sera isoleacutes en fonction de son pouvoir

hydrophile ou lipophile

Bailenger a montreacute que le pH de la solution eacutetait

leacuteleacutement deacuteterminant pour la plus ou moins grande

efficaciteacute dune technique selon le parasite rechercheacute

Principes theacuteoriques

-Les selles tritureacutees (meacutelange au dixiegraveme environ) dans la solution choisie - elle peut ecirctre preacutealablement passeacutee sur un tamis pour eacuteliminer les gros deacutebris

le filtrat est verseacute dans un tube agrave centrifuger agrave fond conique en le remplissant 13

deacutether de maniegravere agrave ce quil y ai 23 du meacutelange selle en laissant 1 cm pour

fermer le tube

- Lrsquoagiter pendant une minute

- La suspension eacutetheacutero-liquide obtenue est centrifugeacutee agrave une vitesse lente de

lordre de 1500 agrave 2000 toursminute pendant une agrave trois minutes

- Apregraves centrifugation les constituants de la suspension sont reacutepartis en quatre

Couches

- Deacutecoller la couche des reacutesidus lipophiles agrave laide dune baguette de verre

- Retourner le tube au dessus de leacutevier (en faisant couler de leau) ou dun bac agrave

deacutechets liquides

- Essuyer les parois du tube avec un coton tenu agrave la pince en laissant toujours le

tube avec louverture dirigeacutee vers le bas pour eacuteviter de souiller le culot avec les

reacutesidus

- Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique pour

remettre en suspension le culot qui sera examineacute

- le culot qui nous inteacuteresse qui contient les eacuteleacutement parasitaires (kystes des

protozoaires)

Ether Debris

Phase aqueuse

Le culot

Les meacutethodes diphasiques sont

-Meacutethode de Telmann 1908

-Meacutethode De Rivas 1928

-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917

-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946

-Meacutethode De Ritchie 1948

-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood

-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf

-Meacutethode De Roman 1957

-Meacutethode de Bailenger 1962-1963

-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle

-Meacutethode de Junod 1927

Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage

Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia

Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)

La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble

lors de la centrifugation ce qui est un argument

diagnostique inteacuteressant

- Inconveacutenients

Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve

restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave

deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses

- Deacuteroulement de la technique

acide aceacutetique cristallisable 5 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethode de Bailenger - Avantages

Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et

des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5

(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)

- Inconveacutenients

Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre

technique est neacutecessaire

- Deacuteroulement de la technique

aceacutetate de sodium 15 g

acide aceacutetique 36 ml

eau distilleacutee qsp 1000 ml

Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide

dun pH-megravetre

Meacutethode de Ritchie simplifieacutee

- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles

formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour

enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les

oeufs dascaris et de schistosome

- Inconveacutenients

Le culot souvent volumineux est de lecture difficile

- Deacuteroulement de la technique

- Solutions de Ritchie

eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt

eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)

Meacutethode de Blagg et al

-Avantages

-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire

les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de

liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de

mercure souille les effluents du laboratoire

- Deacuteroulement de la technique

Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou

additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est

verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation

eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes

Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)

permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute

Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et

recommencer lagitation

On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et

cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee

Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages

-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles

Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes

aiseacutement et facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de

schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue

que les techniques en un temps

- Deacuteroulement de la technique

A) NaCl 9 g

formol officinal 10 ml

eau qsp 1000 ml

B) acide citrique 100 g

formol officinal 20 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethodes combineacutees

Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et

par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande

quantiteacute de selles

Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les

rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des

formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale

- Inconveacutenients

Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez

mal - Deacuteroulement de la technique

A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml

formol officinal 100 ml

eau qsp 1 000 ml

B bromure de sodium cristalliseacute 622 g

eau distilleacutee 1000 ml

Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant

pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou

kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour

trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente

- Inconveacutenients

Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps

assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate

preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)

- Deacuteroulement de la technique

- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)

liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml

eau distilleacutee 334 ml

Concentration diphasique

(MIF ou Bailenger)

une solution de

sulfate de zinc

30 secondes agrave f v

dilueacute au quart avec ED

Examiner

Le culot

Examiner

Le culot

iodomercurate

de potassium

de densiteacute 15

dilueacute au quart avec ED

Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod

simplifieacutee) - Avantages

donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete

- Inconveacutenients

Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi

dune solution de iodomercurate

- Deacuteroulement de la technique

Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)

- aceacutetate de sodium 15 g

- acide aceacutetique cristallisable 20 ml

- formol 40 ml

-eau qsp 1000 ml

Solution B (densiteacute 140)

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 442 volumes

8 g de selles

50 ml de solution de NaCl agrave

85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min

Suspension homo

+Tamisage Examiner

Le culot

eacuteliminer

le surnageant

20 ml dune solution A

+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique

1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min

4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer

le surnageant

Examiner

Le culot

Meacutethode de seacutedimentation-flottation

pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves

- Inconveacutenients

Quand la teneur des selles en lipides est anormalement

eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de

graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique

Solution de densiteacute 135

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 520 volumes

la suspension feacutecale en

eau agrave 85 de NaCl

1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min

1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min

20 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacute

eacuteliminer

le surnageant

5 agrave 7 ml de solution diodomercurate

de potassium de densiteacute 135 20 ml deau

Examen du culot

Seacutedimentation-flottation au saccharose

pour protozoaires - Avantages

permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les

kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand

lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste

na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des

selles fixeacutees au MIF

- Inconveacutenients

Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et

flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De

plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre

que des sels de mercure sont encore utiliseacutes

-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose

saccharose 120 g

eau 200 ml

Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et

utiliser alors

saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml

Suspension homo

+Tamisage +

2 agrave 3 heures

50 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacutee

fraicircche

10 agrave 15 ml de la suspension

1800-2000 toursmin 90sec

rejeter le surnageant

L 1 en12humide

3 agrave 4 g de selles

Seacute

dim

en

tatio

n

8 agrave 10 ml de solution de saccharose

+ 05 ml de solution de chlorure

mercurique agrave 15 en ED

1000 toursmin 45 sec

deacutecanter le

surnageant

dans T2

L 2 en12humide

Flottation

T2 20 agrave 30 ml deau

2000 toursmin90 sec

L 3 en12humide

Preacutecipitation

Les colorations

utile en cas de doute lrsquoidentification des

kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces

des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires

coloreacutees

recommandeacutee pour la conservation de

mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre

laboratoire pour avis

indispensable pour le diagnostic de certains

parasites (Cryptosporides microsporides)

Meacutethodes de coloration rapides

(Colorations en tubes)

- Meacutethode de Bailenger et Faraggi

- Meacutethode de Sapro Lawless et

Strome

-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene

tamporeacute

-Meacutethode de Horkin

- Meacutethode de Sargeaut

-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero

Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de

Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-

formol Apregraves meacutelange

- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave

laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout

-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le

fond du tube

-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en

protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees

immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine

des noyaux est coloreacutee en brun par liode

Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent

donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol

sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement

leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes

- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou

directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension

de selles avec le colorant

Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des

protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux

apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs

jours

la coloration de Bailenger

Laisser pendant une nuit en contact

cristal violet 2 g

fuchsine basique 005 g

alcool agrave 95deg 20 ml

pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml

eau distilleacutee 100 ml

Coloration des frottis

Pour bien observer les structures nucleacuteaires et

garder des lames de reacutefeacuterence on

confectionne un frottis de selles humide et

eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en

- 3 temps fixation puis coloration puis

diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)

- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg

Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)

Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag

- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher

soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains

dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)

soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)

soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1

heure)

-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode

-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau

- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3

30 min agrave leacutetuve agrave 37deg

- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece

24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs

-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au

microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent

nettement

-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau

-Deacuteshydrater

-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est

poseacutee deacutefinitivement

- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les

trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure

des noyaux Les kystes apparaissent en bleu

pacircle avec des noyaux bien nets Cest une

technique facile agrave reacutealiser

- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible

- Plonger la lame dans le fixateur colorant de

Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures

- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au

baume de Canada ou au baume syntheacutetique

Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par

Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie

- Seacutechage

- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol

- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid

- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet

- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20

secondes en agitant

- Rinccedilage

-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5

- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100

- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert

Coloration des microscporidies

Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10

- Effectuer un frottis de la selle

- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de

meacutethanol

- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes

- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord

en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml

- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge

Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee

microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-

Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution

- Colorer pendant 3 heures

- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02

-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-

Rincer seacutecher et lire au grossissement x100

Coloration par Uvitex 2B

Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute

pour la chitine Met en eacutevidence les

microsporidie par une fluorescence

directe On obtient une

fluorescence bleue pale sur fond

noir

Scotch test anal ( test de Graham agrave

la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius

vermicularis ainsi que les anneaux ou les

oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors

de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est

appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant

toute toilette en position foetale ou genou

pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus

et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute

sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera

agrave lrsquoobjectif X10

NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les

parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que

la technique devra ecirctre faite avec des gants

ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite

pour eacuteviter la contamination par les oeufs

auto-infestant de lrsquooxyure

Meacutethodes speacuteciales

Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon

eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs

drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle

de la taille drsquoun petit pois

Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen

des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm

dans une quantiteacute de vert malachite agrave

3 (contre colorant) et de glyceacuterine

appliquer la bande sur la selle et sur la

lame renverser et appuyer sur la

paillasse

Methode de Kato-Katz quantitative

utilise un gabarie pour la selle

Meacutethode efficace pour la recherche

doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale

mais inutilisable pour les kytes et les

larves ainsi que les oeufs dankylostome

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

LA COPROLOGIE

PARASITAIRE

Chapitre 1 Premiegraveres observations des parasites

La coprologie parasitaire ou lrsquoexamen parasitologique des

selles EPS met en eacutevidence et identifie

Les parasites vivants dans le tube digestif Ex Protozoaires et

helminthes (Ascaris lumbricoides tronguiloides stercoralis)

Les parasites pour les quelles les selles sont un moyen drsquoeacutelimination de

leur forme de disseacutemination dans le milieu exteacuterieur Ex Schistosoma mansoni

(vit dans le plexus veineux)

LrsquoEPS mettra en eacutevidence

- une partie du parasite Ex Anneaux deTaenia saginata qui se deacutetachent en

dehors des selles

- une forme eacutevolutive du parasite (larve et oeuf drsquohelminthe) Ex oeuf

drsquoAncylostoma duodenalis

- la forme deacutefinitive du parasite Ex adulte drsquohelminthe Strongyloides stercoralis

les formes veacutegeacutetatives des amibes et des flagelleacutes sont

fragiles dans le milieu exteacuterieur

Preacuteparation du malade

Reacutegime alimentaire limiteacute avant de faire lrsquoexamen Eacuteviter de consommer Les fruits agrave cuticule dure (poires

pommes) Feacuteculents et graines agrave enveloppes segraveches

(lentillefegraveves) Foie drsquoovins ou de bovins

Arrecircter des meacutedicaments - Les antiseptiques intestinaux

- Les antibiotiques et les sulfamides

- Les laxatifs tels que le bismuth le charbon lhuile de paraffine

les suppositoires

--Ne pas faire de radiologie digestive utilisant des produits de

contraste comme la baryte

Fiche clinique

acircge sexe adresse animaux de compagnie profession

(veacuteteacuterinaire agriculteur) habitudes alimentaires statut

immunitaire

PRELEVEMENT

Nombre de preacutelegravevements

Une seul analyse ne permet de deacuteceler la preacutesense

drsquoeacuteleacutements parasitaires que dans 30 des cas

- Rareteacute des eacuteleacutements parasitaires

- Efficaciteacute des techniques utiliseacutees

-Une peacuteriode muette de rejet des eacutelements

caracteacuteristiques (giardiase amibiase)

Il faut dans lrsquoideal pratiquer trois

examens coprologiques agrave quelques

jours drsquointervalle pour affirmer la

neacutegativiteacute

Recueil des selles

-Reacutecipient propre et sec agrave bouchage hermeacutetique

-faire recueillir lrsquoensemble de lrsquoeacutemission

-etiquetage prescripteur nom du patient date

du preacutelegravevement et traitement observeacute si il existe

- les selles ne doit surtout pas ecirctre meacutelanger aux

urines (destruction des formes veacutegeacutetatives)

Deacutelai drsquoexamen

Il faut que la selle parvienne dans les plus brefs deacutelais au

laboratoire afin drsquoeacuteviter la deacutegeacuteneacuterescence des formes

veacutegeacutetatives des protozoaires qui sont sensible agrave la variation

de tempeacuteratures et agrave la deacuteshydratation

Techniques de conservation

Conservation provisoire par le froid (+4degC)

-Bonne conservation des kystes de protozoaires etou

œufs drsquohelminthes

-Mort rapide des trophozoites de protozoaire

-Mort les larves drsquoanguilules

Meacutethode agrave lrsquoeau formoleacutee ( fixation conservation)

-Aldehyde formique( formol) de 5 agrave 20

-Glyceacuterine( facultatif)

-Eau distilleacutee ou lrsquoeau physiologique 100ml La selle +

3 vol 1 vol

tamiser Sedimenter stoker

Bonne conservation œufs drsquohelminthe et kystes de

protozoaires tant que le preacutelegravevement reste liquide

Fixation au MIF (Merthiolate-Iode-Formol)

SOLUTION 1 de mercurothiolate iode

ndashformol

-teinture de mercurethiolate 200 ml

-glycerine 5 ml

-formol agrave 40 25 ml

-eau distilleacutee 250 ml

SOLUTION 2 de Lugol

-iode 05 g

-iode de potassium 1g

-eau distilleacutee 10 ml

1175 ml 075ml +

3 agrave 5 g selles

Triturer stoker

Conservation beaucoups plus longue des

formes veacutegeacutetatives et les kystes de protozoaires

Meacutelange fixateur agrave lrsquoalcool polyvinylique APV

APV

-alcool polyvinylique en poudre

5g

-glyceacuterol 15ml

-eau distilleacutee 625 ml

un bain marie ( 70 -75degC)10mn

Fixateur de Schaudinn modifieacute

-cristaux de clorure de mercure HgCl2

15g

-ethanol agrave 95 31 ml

Acide aceacutetique glacial 5ml +

2 agrave 3 mn

-Bonne conservation

-Une fixtion permettant de pratiquer des

frottis pouvant etre coloreacutes

Concervation des vers

Neacutematotes

Treacutematodes

cestodes

+ eau physiologique Entre 2 lames

Plongeacutes dan un fixteur

Ex - alcool 70 bouillant

- meacutelange alcool et formol

Aspect normal de la selle - poids de 110 agrave 150 g

- couleur brune

- Une consistance ferme et un aspect mouleacute

-- Un pH drsquoenviron 7

Microscopiquement en doit observeacute

-- Des fibres musculaires

-- De la cellulose non digestible poils vaisseaux

ligneux eacuteleacutements scleacutereux

-- de lrsquoamidon si le reacutegime est riche en feacuteculents et chez

lrsquoenfant

-- Quelques masses amorphes ou disques radieacutes ( les

savons)

-- il ne doit pas avoir de globules gras ( graisses

neutres)

COPROLOGIE PARASITAIRE Conduite de lrsquoexamen

1048766 Examen macroscopique

1048766 Examen microscopique

- Examen direct sans concentration

- Examen direct apreacutes concentration

- Les meacutethodes physiques

- Techniques de flottation

- Techniques de seacutedimentation

- Les meacutethodes physico-chimiques

- Les meacutethodes combineacutees

-Colorations speacutecifiques

- cultures

- Examens particuliers

Lrsquoobservation macroscopique Il permet de noter

- Couleur ( brune jaune ou ocre verte

deacutecoloreacutee noire rouge)

- consistance (molle dure liquide)

- aspect (preacutesence de bulles ou de gras

steacuteatorrheacutee)

- Preacutesence drsquoeacuteleacutements surajouteacutes

-Parasites adulte drsquoAscaris femelle drsquooxuyre

anneau ou chaine de taenia

-glaire (mucus)

-sang de pus

Lrsquoexamen direct sans concentration -Lexamen direct est le seule examen qui permet drsquoappreacutecier la vitaliteacute des

parasites

-Il met en eacutevidence les kystes et les formes veacutegeacutetatives de protozoaires ainsi

quelques oeufs et les larves dhelminthes

- On peut rajouter du Lugol double sur la lame qui fixe et colore les

structure nucleacuteaires

- Quelque soit le reacutesultat de lrsquoexamen direct on doit obligatoirement le

compleacuteter par deux techniques de concentration lrsquoune pour les kystes et

lrsquoautre pour les oeufs

- Il est impeacuteratif de connaitre la deacutescription des eacuteleacutements parasitaire et

de retenir les possibles faux parasites

Lrsquoobservation microscopique

une noisette de selle

(agrave diffeacuterents endroits)

lrsquoeau physiologique

agrave 09

suspension homogegravene

2 gouttes sur une

lame recouvrir par

une lamelle

lecture en

zig-zag x10

x 40

+

Les meacutethodes de concentrations

Les techniques par lesquelles on

essaie agrave partir de la grande quantiteacute

de la matieres feacutecales recueillies

drsquoobtenir dans un faible volume les

œufs larves kystes voire formes

veacutegeacutetatifs fixeacutees de parasites par

eacutelimination des reacutesidus de la

digestion

Les meacutethodes physiques

Les selles dilueacutees dans un reacuteactif de densiteacute

diffeacuterente de celle de parasite

DR superieur DP = flottation

DR inferieur DP = seacutedimentation

A-Techniques de flottation

Crsquoest une technique part du principe que la densiteacute du liquide et supeacuterieur

agrave celle des parasites ces derniers plus leacutegers flottent agrave la surface

Les principales techniques de flottation

- Meacutethode de Fullborn (1920) elle utilise une solution satureacutee de NaCl

(NaCl 250g ED 750ml d=12)

- Meacutethode de Willis (1921) simple et utilisable en routine

bullDiluer une noisette de selle dans la solution satureacutee de NaCl agrave 25

bullRemplissez un tube en verre conique jusquagrave sonbord en formant un

meacutenisque concave (verre de montre) sur lequel on deacutepose une lamelle

pendant 15 minutes (pas plus pour eacuteviter la cristalisation des oeufs) On la

deacutepose ensuite sur une lame porte objet et on observe agrave lrsquoobjectif X10 agrave la

recherche des OEufs drsquohelminthes tels que ceux drsquoHymenolepis ou

drsquoAnkylstomes

-Meacutethode de Janeckso et Urbanyi(1931) utilise comme reacuteactif une

solution de domercurate de potassium ( d=114) qui doit etre manipuleacutee

avec prudence

Iodo-mercurate de potassium

Bi iodure de mercure 100g

Iodure de potassium 74g

Eau distilleacutee 50 ml

-Meacutethode de Faust (1938) on centrifuge agrave 1500 tm une dilution des

selles dans lrsquoeau ordinaire tieacutede et on rejette le surnageant et on remet le

culot en suspension dans drsquoeau On reacutepegravete lrsquoopeacuteration jusqursquoagrave ce que le

surnageant soit limpide on remet alors le culot en suspension dans le

sulfate de Zink agrave 33 Apreacutes centrifugation on preacutelegraveve agrave lrsquoanse de

platine la pellicule de surfase qursquoon examine au microscope

- Meacutethode drsquoOtto Hwitt et Straham (1941) on procegravede de la meme

maniere que pour le Willis mais avec une solution aqueuse de sulfate

de Zink agrave 33 D=118

Avantage -Technique simple

-Mateacuteriel rudimentaire

- reacutealisation en seacuterie

-Sensibiliteacute treacutes bonne++++

Inconveacutenient

-Elle a ce pendant lrsquoinconveacutenient drsquoalteacuterer des Larves et les

Kystes pour les quels elle est contre-indiqueacutee ( reactifs

hypertoniques) de mecircme que pour les selles liquides ou

riches en lipides

-Elle donne de bons reacutesultats pour les oeufs drsquohelminthes

leacutegers (oeufs drsquoHymenolepis drsquoAnkylostome et deTaelignia)

B-Techniques de seacutedimentation bullLe diluant a une densiteacute inferieure agrave celle du

parasite alors se dernier se seacutedimente

Les principales techniques

- Meacutethode par seacutedimentation simple

- Meacutethode de Faust et IngallsReacutealiseacutee en utilisant

lrsquoeau glyceacuterineacutee (Eau + Glyceacuterine agrave 05) elle

permet drsquoaugmenter la mouillabiliteacute qui facilite la

seacutedimentation des parasites larves Anguillules

Œufs drsquoAscaris non feacutecondeacutes et œufs de

Schistosoma mansoni

-Meacutethode de Baroody et MostSeacutedimentation

centrifugation Eau de robinet chauffeacutee agrave 42degC

- Meacutethode de Jahnes et Hodges

Avantage -Technique simple

-Mateacuteriel rudimentaire

- reacutealisation en seacuterie

- Traitent une grande masse feacutecale ( parasites rares ou irreacuteguliegraverere ment

repartis dans la selle)

Inconveacutenient -une technique longue agrave reacutealiser

-Les cellules veacutegeacutetales seacutedimentent aussi vite que les parasites (Preacutesence

de certains reacutesidus)

-Non indiqueacutes en routine (sensibiliteacute

moyenne++)

Meacutethodes physico-chimiques ou

Diphasiques Caracteacuteriseacutees par la mise en preacutesence de deux

phases non miscibles lrsquoune aqueuse et lrsquoautre

constitueacutee par lrsquoeacutether qui est un solvant des lipidesil

se creacutee un coefficient de partage entre ces deux

phases et la reacutepartition de chaque eacuteleacutement feacutecal dans

chacune drsquoelles sera isoleacutes en fonction de son pouvoir

hydrophile ou lipophile

Bailenger a montreacute que le pH de la solution eacutetait

leacuteleacutement deacuteterminant pour la plus ou moins grande

efficaciteacute dune technique selon le parasite rechercheacute

Principes theacuteoriques

-Les selles tritureacutees (meacutelange au dixiegraveme environ) dans la solution choisie - elle peut ecirctre preacutealablement passeacutee sur un tamis pour eacuteliminer les gros deacutebris

le filtrat est verseacute dans un tube agrave centrifuger agrave fond conique en le remplissant 13

deacutether de maniegravere agrave ce quil y ai 23 du meacutelange selle en laissant 1 cm pour

fermer le tube

- Lrsquoagiter pendant une minute

- La suspension eacutetheacutero-liquide obtenue est centrifugeacutee agrave une vitesse lente de

lordre de 1500 agrave 2000 toursminute pendant une agrave trois minutes

- Apregraves centrifugation les constituants de la suspension sont reacutepartis en quatre

Couches

- Deacutecoller la couche des reacutesidus lipophiles agrave laide dune baguette de verre

- Retourner le tube au dessus de leacutevier (en faisant couler de leau) ou dun bac agrave

deacutechets liquides

- Essuyer les parois du tube avec un coton tenu agrave la pince en laissant toujours le

tube avec louverture dirigeacutee vers le bas pour eacuteviter de souiller le culot avec les

reacutesidus

- Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique pour

remettre en suspension le culot qui sera examineacute

- le culot qui nous inteacuteresse qui contient les eacuteleacutement parasitaires (kystes des

protozoaires)

Ether Debris

Phase aqueuse

Le culot

Les meacutethodes diphasiques sont

-Meacutethode de Telmann 1908

-Meacutethode De Rivas 1928

-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917

-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946

-Meacutethode De Ritchie 1948

-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood

-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf

-Meacutethode De Roman 1957

-Meacutethode de Bailenger 1962-1963

-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle

-Meacutethode de Junod 1927

Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage

Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia

Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)

La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble

lors de la centrifugation ce qui est un argument

diagnostique inteacuteressant

- Inconveacutenients

Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve

restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave

deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses

- Deacuteroulement de la technique

acide aceacutetique cristallisable 5 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethode de Bailenger - Avantages

Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et

des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5

(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)

- Inconveacutenients

Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre

technique est neacutecessaire

- Deacuteroulement de la technique

aceacutetate de sodium 15 g

acide aceacutetique 36 ml

eau distilleacutee qsp 1000 ml

Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide

dun pH-megravetre

Meacutethode de Ritchie simplifieacutee

- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles

formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour

enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les

oeufs dascaris et de schistosome

- Inconveacutenients

Le culot souvent volumineux est de lecture difficile

- Deacuteroulement de la technique

- Solutions de Ritchie

eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt

eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)

Meacutethode de Blagg et al

-Avantages

-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire

les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de

liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de

mercure souille les effluents du laboratoire

- Deacuteroulement de la technique

Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou

additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est

verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation

eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes

Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)

permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute

Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et

recommencer lagitation

On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et

cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee

Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages

-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles

Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes

aiseacutement et facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de

schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue

que les techniques en un temps

- Deacuteroulement de la technique

A) NaCl 9 g

formol officinal 10 ml

eau qsp 1000 ml

B) acide citrique 100 g

formol officinal 20 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethodes combineacutees

Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et

par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande

quantiteacute de selles

Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les

rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des

formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale

- Inconveacutenients

Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez

mal - Deacuteroulement de la technique

A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml

formol officinal 100 ml

eau qsp 1 000 ml

B bromure de sodium cristalliseacute 622 g

eau distilleacutee 1000 ml

Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant

pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou

kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour

trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente

- Inconveacutenients

Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps

assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate

preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)

- Deacuteroulement de la technique

- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)

liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml

eau distilleacutee 334 ml

Concentration diphasique

(MIF ou Bailenger)

une solution de

sulfate de zinc

30 secondes agrave f v

dilueacute au quart avec ED

Examiner

Le culot

Examiner

Le culot

iodomercurate

de potassium

de densiteacute 15

dilueacute au quart avec ED

Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod

simplifieacutee) - Avantages

donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete

- Inconveacutenients

Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi

dune solution de iodomercurate

- Deacuteroulement de la technique

Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)

- aceacutetate de sodium 15 g

- acide aceacutetique cristallisable 20 ml

- formol 40 ml

-eau qsp 1000 ml

Solution B (densiteacute 140)

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 442 volumes

8 g de selles

50 ml de solution de NaCl agrave

85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min

Suspension homo

+Tamisage Examiner

Le culot

eacuteliminer

le surnageant

20 ml dune solution A

+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique

1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min

4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer

le surnageant

Examiner

Le culot

Meacutethode de seacutedimentation-flottation

pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves

- Inconveacutenients

Quand la teneur des selles en lipides est anormalement

eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de

graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique

Solution de densiteacute 135

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 520 volumes

la suspension feacutecale en

eau agrave 85 de NaCl

1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min

1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min

20 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacute

eacuteliminer

le surnageant

5 agrave 7 ml de solution diodomercurate

de potassium de densiteacute 135 20 ml deau

Examen du culot

Seacutedimentation-flottation au saccharose

pour protozoaires - Avantages

permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les

kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand

lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste

na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des

selles fixeacutees au MIF

- Inconveacutenients

Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et

flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De

plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre

que des sels de mercure sont encore utiliseacutes

-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose

saccharose 120 g

eau 200 ml

Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et

utiliser alors

saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml

Suspension homo

+Tamisage +

2 agrave 3 heures

50 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacutee

fraicircche

10 agrave 15 ml de la suspension

1800-2000 toursmin 90sec

rejeter le surnageant

L 1 en12humide

3 agrave 4 g de selles

Seacute

dim

en

tatio

n

8 agrave 10 ml de solution de saccharose

+ 05 ml de solution de chlorure

mercurique agrave 15 en ED

1000 toursmin 45 sec

deacutecanter le

surnageant

dans T2

L 2 en12humide

Flottation

T2 20 agrave 30 ml deau

2000 toursmin90 sec

L 3 en12humide

Preacutecipitation

Les colorations

utile en cas de doute lrsquoidentification des

kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces

des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires

coloreacutees

recommandeacutee pour la conservation de

mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre

laboratoire pour avis

indispensable pour le diagnostic de certains

parasites (Cryptosporides microsporides)

Meacutethodes de coloration rapides

(Colorations en tubes)

- Meacutethode de Bailenger et Faraggi

- Meacutethode de Sapro Lawless et

Strome

-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene

tamporeacute

-Meacutethode de Horkin

- Meacutethode de Sargeaut

-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero

Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de

Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-

formol Apregraves meacutelange

- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave

laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout

-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le

fond du tube

-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en

protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees

immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine

des noyaux est coloreacutee en brun par liode

Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent

donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol

sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement

leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes

- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou

directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension

de selles avec le colorant

Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des

protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux

apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs

jours

la coloration de Bailenger

Laisser pendant une nuit en contact

cristal violet 2 g

fuchsine basique 005 g

alcool agrave 95deg 20 ml

pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml

eau distilleacutee 100 ml

Coloration des frottis

Pour bien observer les structures nucleacuteaires et

garder des lames de reacutefeacuterence on

confectionne un frottis de selles humide et

eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en

- 3 temps fixation puis coloration puis

diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)

- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg

Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)

Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag

- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher

soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains

dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)

soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)

soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1

heure)

-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode

-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau

- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3

30 min agrave leacutetuve agrave 37deg

- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece

24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs

-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au

microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent

nettement

-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau

-Deacuteshydrater

-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est

poseacutee deacutefinitivement

- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les

trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure

des noyaux Les kystes apparaissent en bleu

pacircle avec des noyaux bien nets Cest une

technique facile agrave reacutealiser

- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible

- Plonger la lame dans le fixateur colorant de

Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures

- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au

baume de Canada ou au baume syntheacutetique

Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par

Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie

- Seacutechage

- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol

- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid

- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet

- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20

secondes en agitant

- Rinccedilage

-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5

- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100

- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert

Coloration des microscporidies

Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10

- Effectuer un frottis de la selle

- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de

meacutethanol

- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes

- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord

en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml

- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge

Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee

microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-

Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution

- Colorer pendant 3 heures

- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02

-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-

Rincer seacutecher et lire au grossissement x100

Coloration par Uvitex 2B

Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute

pour la chitine Met en eacutevidence les

microsporidie par une fluorescence

directe On obtient une

fluorescence bleue pale sur fond

noir

Scotch test anal ( test de Graham agrave

la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius

vermicularis ainsi que les anneaux ou les

oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors

de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est

appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant

toute toilette en position foetale ou genou

pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus

et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute

sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera

agrave lrsquoobjectif X10

NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les

parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que

la technique devra ecirctre faite avec des gants

ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite

pour eacuteviter la contamination par les oeufs

auto-infestant de lrsquooxyure

Meacutethodes speacuteciales

Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon

eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs

drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle

de la taille drsquoun petit pois

Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen

des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm

dans une quantiteacute de vert malachite agrave

3 (contre colorant) et de glyceacuterine

appliquer la bande sur la selle et sur la

lame renverser et appuyer sur la

paillasse

Methode de Kato-Katz quantitative

utilise un gabarie pour la selle

Meacutethode efficace pour la recherche

doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale

mais inutilisable pour les kytes et les

larves ainsi que les oeufs dankylostome

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

La coprologie parasitaire ou lrsquoexamen parasitologique des

selles EPS met en eacutevidence et identifie

Les parasites vivants dans le tube digestif Ex Protozoaires et

helminthes (Ascaris lumbricoides tronguiloides stercoralis)

Les parasites pour les quelles les selles sont un moyen drsquoeacutelimination de

leur forme de disseacutemination dans le milieu exteacuterieur Ex Schistosoma mansoni

(vit dans le plexus veineux)

LrsquoEPS mettra en eacutevidence

- une partie du parasite Ex Anneaux deTaenia saginata qui se deacutetachent en

dehors des selles

- une forme eacutevolutive du parasite (larve et oeuf drsquohelminthe) Ex oeuf

drsquoAncylostoma duodenalis

- la forme deacutefinitive du parasite Ex adulte drsquohelminthe Strongyloides stercoralis

les formes veacutegeacutetatives des amibes et des flagelleacutes sont

fragiles dans le milieu exteacuterieur

Preacuteparation du malade

Reacutegime alimentaire limiteacute avant de faire lrsquoexamen Eacuteviter de consommer Les fruits agrave cuticule dure (poires

pommes) Feacuteculents et graines agrave enveloppes segraveches

(lentillefegraveves) Foie drsquoovins ou de bovins

Arrecircter des meacutedicaments - Les antiseptiques intestinaux

- Les antibiotiques et les sulfamides

- Les laxatifs tels que le bismuth le charbon lhuile de paraffine

les suppositoires

--Ne pas faire de radiologie digestive utilisant des produits de

contraste comme la baryte

Fiche clinique

acircge sexe adresse animaux de compagnie profession

(veacuteteacuterinaire agriculteur) habitudes alimentaires statut

immunitaire

PRELEVEMENT

Nombre de preacutelegravevements

Une seul analyse ne permet de deacuteceler la preacutesense

drsquoeacuteleacutements parasitaires que dans 30 des cas

- Rareteacute des eacuteleacutements parasitaires

- Efficaciteacute des techniques utiliseacutees

-Une peacuteriode muette de rejet des eacutelements

caracteacuteristiques (giardiase amibiase)

Il faut dans lrsquoideal pratiquer trois

examens coprologiques agrave quelques

jours drsquointervalle pour affirmer la

neacutegativiteacute

Recueil des selles

-Reacutecipient propre et sec agrave bouchage hermeacutetique

-faire recueillir lrsquoensemble de lrsquoeacutemission

-etiquetage prescripteur nom du patient date

du preacutelegravevement et traitement observeacute si il existe

- les selles ne doit surtout pas ecirctre meacutelanger aux

urines (destruction des formes veacutegeacutetatives)

Deacutelai drsquoexamen

Il faut que la selle parvienne dans les plus brefs deacutelais au

laboratoire afin drsquoeacuteviter la deacutegeacuteneacuterescence des formes

veacutegeacutetatives des protozoaires qui sont sensible agrave la variation

de tempeacuteratures et agrave la deacuteshydratation

Techniques de conservation

Conservation provisoire par le froid (+4degC)

-Bonne conservation des kystes de protozoaires etou

œufs drsquohelminthes

-Mort rapide des trophozoites de protozoaire

-Mort les larves drsquoanguilules

Meacutethode agrave lrsquoeau formoleacutee ( fixation conservation)

-Aldehyde formique( formol) de 5 agrave 20

-Glyceacuterine( facultatif)

-Eau distilleacutee ou lrsquoeau physiologique 100ml La selle +

3 vol 1 vol

tamiser Sedimenter stoker

Bonne conservation œufs drsquohelminthe et kystes de

protozoaires tant que le preacutelegravevement reste liquide

Fixation au MIF (Merthiolate-Iode-Formol)

SOLUTION 1 de mercurothiolate iode

ndashformol

-teinture de mercurethiolate 200 ml

-glycerine 5 ml

-formol agrave 40 25 ml

-eau distilleacutee 250 ml

SOLUTION 2 de Lugol

-iode 05 g

-iode de potassium 1g

-eau distilleacutee 10 ml

1175 ml 075ml +

3 agrave 5 g selles

Triturer stoker

Conservation beaucoups plus longue des

formes veacutegeacutetatives et les kystes de protozoaires

Meacutelange fixateur agrave lrsquoalcool polyvinylique APV

APV

-alcool polyvinylique en poudre

5g

-glyceacuterol 15ml

-eau distilleacutee 625 ml

un bain marie ( 70 -75degC)10mn

Fixateur de Schaudinn modifieacute

-cristaux de clorure de mercure HgCl2

15g

-ethanol agrave 95 31 ml

Acide aceacutetique glacial 5ml +

2 agrave 3 mn

-Bonne conservation

-Une fixtion permettant de pratiquer des

frottis pouvant etre coloreacutes

Concervation des vers

Neacutematotes

Treacutematodes

cestodes

+ eau physiologique Entre 2 lames

Plongeacutes dan un fixteur

Ex - alcool 70 bouillant

- meacutelange alcool et formol

Aspect normal de la selle - poids de 110 agrave 150 g

- couleur brune

- Une consistance ferme et un aspect mouleacute

-- Un pH drsquoenviron 7

Microscopiquement en doit observeacute

-- Des fibres musculaires

-- De la cellulose non digestible poils vaisseaux

ligneux eacuteleacutements scleacutereux

-- de lrsquoamidon si le reacutegime est riche en feacuteculents et chez

lrsquoenfant

-- Quelques masses amorphes ou disques radieacutes ( les

savons)

-- il ne doit pas avoir de globules gras ( graisses

neutres)

COPROLOGIE PARASITAIRE Conduite de lrsquoexamen

1048766 Examen macroscopique

1048766 Examen microscopique

- Examen direct sans concentration

- Examen direct apreacutes concentration

- Les meacutethodes physiques

- Techniques de flottation

- Techniques de seacutedimentation

- Les meacutethodes physico-chimiques

- Les meacutethodes combineacutees

-Colorations speacutecifiques

- cultures

- Examens particuliers

Lrsquoobservation macroscopique Il permet de noter

- Couleur ( brune jaune ou ocre verte

deacutecoloreacutee noire rouge)

- consistance (molle dure liquide)

- aspect (preacutesence de bulles ou de gras

steacuteatorrheacutee)

- Preacutesence drsquoeacuteleacutements surajouteacutes

-Parasites adulte drsquoAscaris femelle drsquooxuyre

anneau ou chaine de taenia

-glaire (mucus)

-sang de pus

Lrsquoexamen direct sans concentration -Lexamen direct est le seule examen qui permet drsquoappreacutecier la vitaliteacute des

parasites

-Il met en eacutevidence les kystes et les formes veacutegeacutetatives de protozoaires ainsi

quelques oeufs et les larves dhelminthes

- On peut rajouter du Lugol double sur la lame qui fixe et colore les

structure nucleacuteaires

- Quelque soit le reacutesultat de lrsquoexamen direct on doit obligatoirement le

compleacuteter par deux techniques de concentration lrsquoune pour les kystes et

lrsquoautre pour les oeufs

- Il est impeacuteratif de connaitre la deacutescription des eacuteleacutements parasitaire et

de retenir les possibles faux parasites

Lrsquoobservation microscopique

une noisette de selle

(agrave diffeacuterents endroits)

lrsquoeau physiologique

agrave 09

suspension homogegravene

2 gouttes sur une

lame recouvrir par

une lamelle

lecture en

zig-zag x10

x 40

+

Les meacutethodes de concentrations

Les techniques par lesquelles on

essaie agrave partir de la grande quantiteacute

de la matieres feacutecales recueillies

drsquoobtenir dans un faible volume les

œufs larves kystes voire formes

veacutegeacutetatifs fixeacutees de parasites par

eacutelimination des reacutesidus de la

digestion

Les meacutethodes physiques

Les selles dilueacutees dans un reacuteactif de densiteacute

diffeacuterente de celle de parasite

DR superieur DP = flottation

DR inferieur DP = seacutedimentation

A-Techniques de flottation

Crsquoest une technique part du principe que la densiteacute du liquide et supeacuterieur

agrave celle des parasites ces derniers plus leacutegers flottent agrave la surface

Les principales techniques de flottation

- Meacutethode de Fullborn (1920) elle utilise une solution satureacutee de NaCl

(NaCl 250g ED 750ml d=12)

- Meacutethode de Willis (1921) simple et utilisable en routine

bullDiluer une noisette de selle dans la solution satureacutee de NaCl agrave 25

bullRemplissez un tube en verre conique jusquagrave sonbord en formant un

meacutenisque concave (verre de montre) sur lequel on deacutepose une lamelle

pendant 15 minutes (pas plus pour eacuteviter la cristalisation des oeufs) On la

deacutepose ensuite sur une lame porte objet et on observe agrave lrsquoobjectif X10 agrave la

recherche des OEufs drsquohelminthes tels que ceux drsquoHymenolepis ou

drsquoAnkylstomes

-Meacutethode de Janeckso et Urbanyi(1931) utilise comme reacuteactif une

solution de domercurate de potassium ( d=114) qui doit etre manipuleacutee

avec prudence

Iodo-mercurate de potassium

Bi iodure de mercure 100g

Iodure de potassium 74g

Eau distilleacutee 50 ml

-Meacutethode de Faust (1938) on centrifuge agrave 1500 tm une dilution des

selles dans lrsquoeau ordinaire tieacutede et on rejette le surnageant et on remet le

culot en suspension dans drsquoeau On reacutepegravete lrsquoopeacuteration jusqursquoagrave ce que le

surnageant soit limpide on remet alors le culot en suspension dans le

sulfate de Zink agrave 33 Apreacutes centrifugation on preacutelegraveve agrave lrsquoanse de

platine la pellicule de surfase qursquoon examine au microscope

- Meacutethode drsquoOtto Hwitt et Straham (1941) on procegravede de la meme

maniere que pour le Willis mais avec une solution aqueuse de sulfate

de Zink agrave 33 D=118

Avantage -Technique simple

-Mateacuteriel rudimentaire

- reacutealisation en seacuterie

-Sensibiliteacute treacutes bonne++++

Inconveacutenient

-Elle a ce pendant lrsquoinconveacutenient drsquoalteacuterer des Larves et les

Kystes pour les quels elle est contre-indiqueacutee ( reactifs

hypertoniques) de mecircme que pour les selles liquides ou

riches en lipides

-Elle donne de bons reacutesultats pour les oeufs drsquohelminthes

leacutegers (oeufs drsquoHymenolepis drsquoAnkylostome et deTaelignia)

B-Techniques de seacutedimentation bullLe diluant a une densiteacute inferieure agrave celle du

parasite alors se dernier se seacutedimente

Les principales techniques

- Meacutethode par seacutedimentation simple

- Meacutethode de Faust et IngallsReacutealiseacutee en utilisant

lrsquoeau glyceacuterineacutee (Eau + Glyceacuterine agrave 05) elle

permet drsquoaugmenter la mouillabiliteacute qui facilite la

seacutedimentation des parasites larves Anguillules

Œufs drsquoAscaris non feacutecondeacutes et œufs de

Schistosoma mansoni

-Meacutethode de Baroody et MostSeacutedimentation

centrifugation Eau de robinet chauffeacutee agrave 42degC

- Meacutethode de Jahnes et Hodges

Avantage -Technique simple

-Mateacuteriel rudimentaire

- reacutealisation en seacuterie

- Traitent une grande masse feacutecale ( parasites rares ou irreacuteguliegraverere ment

repartis dans la selle)

Inconveacutenient -une technique longue agrave reacutealiser

-Les cellules veacutegeacutetales seacutedimentent aussi vite que les parasites (Preacutesence

de certains reacutesidus)

-Non indiqueacutes en routine (sensibiliteacute

moyenne++)

Meacutethodes physico-chimiques ou

Diphasiques Caracteacuteriseacutees par la mise en preacutesence de deux

phases non miscibles lrsquoune aqueuse et lrsquoautre

constitueacutee par lrsquoeacutether qui est un solvant des lipidesil

se creacutee un coefficient de partage entre ces deux

phases et la reacutepartition de chaque eacuteleacutement feacutecal dans

chacune drsquoelles sera isoleacutes en fonction de son pouvoir

hydrophile ou lipophile

Bailenger a montreacute que le pH de la solution eacutetait

leacuteleacutement deacuteterminant pour la plus ou moins grande

efficaciteacute dune technique selon le parasite rechercheacute

Principes theacuteoriques

-Les selles tritureacutees (meacutelange au dixiegraveme environ) dans la solution choisie - elle peut ecirctre preacutealablement passeacutee sur un tamis pour eacuteliminer les gros deacutebris

le filtrat est verseacute dans un tube agrave centrifuger agrave fond conique en le remplissant 13

deacutether de maniegravere agrave ce quil y ai 23 du meacutelange selle en laissant 1 cm pour

fermer le tube

- Lrsquoagiter pendant une minute

- La suspension eacutetheacutero-liquide obtenue est centrifugeacutee agrave une vitesse lente de

lordre de 1500 agrave 2000 toursminute pendant une agrave trois minutes

- Apregraves centrifugation les constituants de la suspension sont reacutepartis en quatre

Couches

- Deacutecoller la couche des reacutesidus lipophiles agrave laide dune baguette de verre

- Retourner le tube au dessus de leacutevier (en faisant couler de leau) ou dun bac agrave

deacutechets liquides

- Essuyer les parois du tube avec un coton tenu agrave la pince en laissant toujours le

tube avec louverture dirigeacutee vers le bas pour eacuteviter de souiller le culot avec les

reacutesidus

- Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique pour

remettre en suspension le culot qui sera examineacute

- le culot qui nous inteacuteresse qui contient les eacuteleacutement parasitaires (kystes des

protozoaires)

Ether Debris

Phase aqueuse

Le culot

Les meacutethodes diphasiques sont

-Meacutethode de Telmann 1908

-Meacutethode De Rivas 1928

-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917

-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946

-Meacutethode De Ritchie 1948

-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood

-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf

-Meacutethode De Roman 1957

-Meacutethode de Bailenger 1962-1963

-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle

-Meacutethode de Junod 1927

Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage

Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia

Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)

La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble

lors de la centrifugation ce qui est un argument

diagnostique inteacuteressant

- Inconveacutenients

Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve

restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave

deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses

- Deacuteroulement de la technique

acide aceacutetique cristallisable 5 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethode de Bailenger - Avantages

Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et

des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5

(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)

- Inconveacutenients

Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre

technique est neacutecessaire

- Deacuteroulement de la technique

aceacutetate de sodium 15 g

acide aceacutetique 36 ml

eau distilleacutee qsp 1000 ml

Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide

dun pH-megravetre

Meacutethode de Ritchie simplifieacutee

- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles

formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour

enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les

oeufs dascaris et de schistosome

- Inconveacutenients

Le culot souvent volumineux est de lecture difficile

- Deacuteroulement de la technique

- Solutions de Ritchie

eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt

eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)

Meacutethode de Blagg et al

-Avantages

-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire

les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de

liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de

mercure souille les effluents du laboratoire

- Deacuteroulement de la technique

Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou

additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est

verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation

eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes

Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)

permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute

Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et

recommencer lagitation

On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et

cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee

Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages

-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles

Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes

aiseacutement et facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de

schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue

que les techniques en un temps

- Deacuteroulement de la technique

A) NaCl 9 g

formol officinal 10 ml

eau qsp 1000 ml

B) acide citrique 100 g

formol officinal 20 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethodes combineacutees

Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et

par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande

quantiteacute de selles

Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les

rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des

formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale

- Inconveacutenients

Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez

mal - Deacuteroulement de la technique

A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml

formol officinal 100 ml

eau qsp 1 000 ml

B bromure de sodium cristalliseacute 622 g

eau distilleacutee 1000 ml

Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant

pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou

kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour

trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente

- Inconveacutenients

Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps

assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate

preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)

- Deacuteroulement de la technique

- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)

liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml

eau distilleacutee 334 ml

Concentration diphasique

(MIF ou Bailenger)

une solution de

sulfate de zinc

30 secondes agrave f v

dilueacute au quart avec ED

Examiner

Le culot

Examiner

Le culot

iodomercurate

de potassium

de densiteacute 15

dilueacute au quart avec ED

Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod

simplifieacutee) - Avantages

donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete

- Inconveacutenients

Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi

dune solution de iodomercurate

- Deacuteroulement de la technique

Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)

- aceacutetate de sodium 15 g

- acide aceacutetique cristallisable 20 ml

- formol 40 ml

-eau qsp 1000 ml

Solution B (densiteacute 140)

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 442 volumes

8 g de selles

50 ml de solution de NaCl agrave

85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min

Suspension homo

+Tamisage Examiner

Le culot

eacuteliminer

le surnageant

20 ml dune solution A

+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique

1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min

4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer

le surnageant

Examiner

Le culot

Meacutethode de seacutedimentation-flottation

pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves

- Inconveacutenients

Quand la teneur des selles en lipides est anormalement

eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de

graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique

Solution de densiteacute 135

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 520 volumes

la suspension feacutecale en

eau agrave 85 de NaCl

1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min

1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min

20 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacute

eacuteliminer

le surnageant

5 agrave 7 ml de solution diodomercurate

de potassium de densiteacute 135 20 ml deau

Examen du culot

Seacutedimentation-flottation au saccharose

pour protozoaires - Avantages

permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les

kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand

lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste

na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des

selles fixeacutees au MIF

- Inconveacutenients

Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et

flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De

plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre

que des sels de mercure sont encore utiliseacutes

-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose

saccharose 120 g

eau 200 ml

Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et

utiliser alors

saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml

Suspension homo

+Tamisage +

2 agrave 3 heures

50 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacutee

fraicircche

10 agrave 15 ml de la suspension

1800-2000 toursmin 90sec

rejeter le surnageant

L 1 en12humide

3 agrave 4 g de selles

Seacute

dim

en

tatio

n

8 agrave 10 ml de solution de saccharose

+ 05 ml de solution de chlorure

mercurique agrave 15 en ED

1000 toursmin 45 sec

deacutecanter le

surnageant

dans T2

L 2 en12humide

Flottation

T2 20 agrave 30 ml deau

2000 toursmin90 sec

L 3 en12humide

Preacutecipitation

Les colorations

utile en cas de doute lrsquoidentification des

kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces

des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires

coloreacutees

recommandeacutee pour la conservation de

mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre

laboratoire pour avis

indispensable pour le diagnostic de certains

parasites (Cryptosporides microsporides)

Meacutethodes de coloration rapides

(Colorations en tubes)

- Meacutethode de Bailenger et Faraggi

- Meacutethode de Sapro Lawless et

Strome

-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene

tamporeacute

-Meacutethode de Horkin

- Meacutethode de Sargeaut

-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero

Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de

Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-

formol Apregraves meacutelange

- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave

laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout

-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le

fond du tube

-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en

protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees

immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine

des noyaux est coloreacutee en brun par liode

Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent

donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol

sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement

leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes

- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou

directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension

de selles avec le colorant

Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des

protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux

apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs

jours

la coloration de Bailenger

Laisser pendant une nuit en contact

cristal violet 2 g

fuchsine basique 005 g

alcool agrave 95deg 20 ml

pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml

eau distilleacutee 100 ml

Coloration des frottis

Pour bien observer les structures nucleacuteaires et

garder des lames de reacutefeacuterence on

confectionne un frottis de selles humide et

eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en

- 3 temps fixation puis coloration puis

diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)

- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg

Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)

Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag

- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher

soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains

dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)

soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)

soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1

heure)

-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode

-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau

- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3

30 min agrave leacutetuve agrave 37deg

- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece

24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs

-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au

microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent

nettement

-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau

-Deacuteshydrater

-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est

poseacutee deacutefinitivement

- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les

trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure

des noyaux Les kystes apparaissent en bleu

pacircle avec des noyaux bien nets Cest une

technique facile agrave reacutealiser

- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible

- Plonger la lame dans le fixateur colorant de

Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures

- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au

baume de Canada ou au baume syntheacutetique

Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par

Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie

- Seacutechage

- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol

- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid

- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet

- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20

secondes en agitant

- Rinccedilage

-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5

- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100

- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert

Coloration des microscporidies

Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10

- Effectuer un frottis de la selle

- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de

meacutethanol

- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes

- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord

en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml

- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge

Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee

microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-

Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution

- Colorer pendant 3 heures

- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02

-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-

Rincer seacutecher et lire au grossissement x100

Coloration par Uvitex 2B

Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute

pour la chitine Met en eacutevidence les

microsporidie par une fluorescence

directe On obtient une

fluorescence bleue pale sur fond

noir

Scotch test anal ( test de Graham agrave

la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius

vermicularis ainsi que les anneaux ou les

oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors

de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est

appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant

toute toilette en position foetale ou genou

pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus

et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute

sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera

agrave lrsquoobjectif X10

NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les

parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que

la technique devra ecirctre faite avec des gants

ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite

pour eacuteviter la contamination par les oeufs

auto-infestant de lrsquooxyure

Meacutethodes speacuteciales

Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon

eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs

drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle

de la taille drsquoun petit pois

Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen

des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm

dans une quantiteacute de vert malachite agrave

3 (contre colorant) et de glyceacuterine

appliquer la bande sur la selle et sur la

lame renverser et appuyer sur la

paillasse

Methode de Kato-Katz quantitative

utilise un gabarie pour la selle

Meacutethode efficace pour la recherche

doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale

mais inutilisable pour les kytes et les

larves ainsi que les oeufs dankylostome

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

Preacuteparation du malade

Reacutegime alimentaire limiteacute avant de faire lrsquoexamen Eacuteviter de consommer Les fruits agrave cuticule dure (poires

pommes) Feacuteculents et graines agrave enveloppes segraveches

(lentillefegraveves) Foie drsquoovins ou de bovins

Arrecircter des meacutedicaments - Les antiseptiques intestinaux

- Les antibiotiques et les sulfamides

- Les laxatifs tels que le bismuth le charbon lhuile de paraffine

les suppositoires

--Ne pas faire de radiologie digestive utilisant des produits de

contraste comme la baryte

Fiche clinique

acircge sexe adresse animaux de compagnie profession

(veacuteteacuterinaire agriculteur) habitudes alimentaires statut

immunitaire

PRELEVEMENT

Nombre de preacutelegravevements

Une seul analyse ne permet de deacuteceler la preacutesense

drsquoeacuteleacutements parasitaires que dans 30 des cas

- Rareteacute des eacuteleacutements parasitaires

- Efficaciteacute des techniques utiliseacutees

-Une peacuteriode muette de rejet des eacutelements

caracteacuteristiques (giardiase amibiase)

Il faut dans lrsquoideal pratiquer trois

examens coprologiques agrave quelques

jours drsquointervalle pour affirmer la

neacutegativiteacute

Recueil des selles

-Reacutecipient propre et sec agrave bouchage hermeacutetique

-faire recueillir lrsquoensemble de lrsquoeacutemission

-etiquetage prescripteur nom du patient date

du preacutelegravevement et traitement observeacute si il existe

- les selles ne doit surtout pas ecirctre meacutelanger aux

urines (destruction des formes veacutegeacutetatives)

Deacutelai drsquoexamen

Il faut que la selle parvienne dans les plus brefs deacutelais au

laboratoire afin drsquoeacuteviter la deacutegeacuteneacuterescence des formes

veacutegeacutetatives des protozoaires qui sont sensible agrave la variation

de tempeacuteratures et agrave la deacuteshydratation

Techniques de conservation

Conservation provisoire par le froid (+4degC)

-Bonne conservation des kystes de protozoaires etou

œufs drsquohelminthes

-Mort rapide des trophozoites de protozoaire

-Mort les larves drsquoanguilules

Meacutethode agrave lrsquoeau formoleacutee ( fixation conservation)

-Aldehyde formique( formol) de 5 agrave 20

-Glyceacuterine( facultatif)

-Eau distilleacutee ou lrsquoeau physiologique 100ml La selle +

3 vol 1 vol

tamiser Sedimenter stoker

Bonne conservation œufs drsquohelminthe et kystes de

protozoaires tant que le preacutelegravevement reste liquide

Fixation au MIF (Merthiolate-Iode-Formol)

SOLUTION 1 de mercurothiolate iode

ndashformol

-teinture de mercurethiolate 200 ml

-glycerine 5 ml

-formol agrave 40 25 ml

-eau distilleacutee 250 ml

SOLUTION 2 de Lugol

-iode 05 g

-iode de potassium 1g

-eau distilleacutee 10 ml

1175 ml 075ml +

3 agrave 5 g selles

Triturer stoker

Conservation beaucoups plus longue des

formes veacutegeacutetatives et les kystes de protozoaires

Meacutelange fixateur agrave lrsquoalcool polyvinylique APV

APV

-alcool polyvinylique en poudre

5g

-glyceacuterol 15ml

-eau distilleacutee 625 ml

un bain marie ( 70 -75degC)10mn

Fixateur de Schaudinn modifieacute

-cristaux de clorure de mercure HgCl2

15g

-ethanol agrave 95 31 ml

Acide aceacutetique glacial 5ml +

2 agrave 3 mn

-Bonne conservation

-Une fixtion permettant de pratiquer des

frottis pouvant etre coloreacutes

Concervation des vers

Neacutematotes

Treacutematodes

cestodes

+ eau physiologique Entre 2 lames

Plongeacutes dan un fixteur

Ex - alcool 70 bouillant

- meacutelange alcool et formol

Aspect normal de la selle - poids de 110 agrave 150 g

- couleur brune

- Une consistance ferme et un aspect mouleacute

-- Un pH drsquoenviron 7

Microscopiquement en doit observeacute

-- Des fibres musculaires

-- De la cellulose non digestible poils vaisseaux

ligneux eacuteleacutements scleacutereux

-- de lrsquoamidon si le reacutegime est riche en feacuteculents et chez

lrsquoenfant

-- Quelques masses amorphes ou disques radieacutes ( les

savons)

-- il ne doit pas avoir de globules gras ( graisses

neutres)

COPROLOGIE PARASITAIRE Conduite de lrsquoexamen

1048766 Examen macroscopique

1048766 Examen microscopique

- Examen direct sans concentration

- Examen direct apreacutes concentration

- Les meacutethodes physiques

- Techniques de flottation

- Techniques de seacutedimentation

- Les meacutethodes physico-chimiques

- Les meacutethodes combineacutees

-Colorations speacutecifiques

- cultures

- Examens particuliers

Lrsquoobservation macroscopique Il permet de noter

- Couleur ( brune jaune ou ocre verte

deacutecoloreacutee noire rouge)

- consistance (molle dure liquide)

- aspect (preacutesence de bulles ou de gras

steacuteatorrheacutee)

- Preacutesence drsquoeacuteleacutements surajouteacutes

-Parasites adulte drsquoAscaris femelle drsquooxuyre

anneau ou chaine de taenia

-glaire (mucus)

-sang de pus

Lrsquoexamen direct sans concentration -Lexamen direct est le seule examen qui permet drsquoappreacutecier la vitaliteacute des

parasites

-Il met en eacutevidence les kystes et les formes veacutegeacutetatives de protozoaires ainsi

quelques oeufs et les larves dhelminthes

- On peut rajouter du Lugol double sur la lame qui fixe et colore les

structure nucleacuteaires

- Quelque soit le reacutesultat de lrsquoexamen direct on doit obligatoirement le

compleacuteter par deux techniques de concentration lrsquoune pour les kystes et

lrsquoautre pour les oeufs

- Il est impeacuteratif de connaitre la deacutescription des eacuteleacutements parasitaire et

de retenir les possibles faux parasites

Lrsquoobservation microscopique

une noisette de selle

(agrave diffeacuterents endroits)

lrsquoeau physiologique

agrave 09

suspension homogegravene

2 gouttes sur une

lame recouvrir par

une lamelle

lecture en

zig-zag x10

x 40

+

Les meacutethodes de concentrations

Les techniques par lesquelles on

essaie agrave partir de la grande quantiteacute

de la matieres feacutecales recueillies

drsquoobtenir dans un faible volume les

œufs larves kystes voire formes

veacutegeacutetatifs fixeacutees de parasites par

eacutelimination des reacutesidus de la

digestion

Les meacutethodes physiques

Les selles dilueacutees dans un reacuteactif de densiteacute

diffeacuterente de celle de parasite

DR superieur DP = flottation

DR inferieur DP = seacutedimentation

A-Techniques de flottation

Crsquoest une technique part du principe que la densiteacute du liquide et supeacuterieur

agrave celle des parasites ces derniers plus leacutegers flottent agrave la surface

Les principales techniques de flottation

- Meacutethode de Fullborn (1920) elle utilise une solution satureacutee de NaCl

(NaCl 250g ED 750ml d=12)

- Meacutethode de Willis (1921) simple et utilisable en routine

bullDiluer une noisette de selle dans la solution satureacutee de NaCl agrave 25

bullRemplissez un tube en verre conique jusquagrave sonbord en formant un

meacutenisque concave (verre de montre) sur lequel on deacutepose une lamelle

pendant 15 minutes (pas plus pour eacuteviter la cristalisation des oeufs) On la

deacutepose ensuite sur une lame porte objet et on observe agrave lrsquoobjectif X10 agrave la

recherche des OEufs drsquohelminthes tels que ceux drsquoHymenolepis ou

drsquoAnkylstomes

-Meacutethode de Janeckso et Urbanyi(1931) utilise comme reacuteactif une

solution de domercurate de potassium ( d=114) qui doit etre manipuleacutee

avec prudence

Iodo-mercurate de potassium

Bi iodure de mercure 100g

Iodure de potassium 74g

Eau distilleacutee 50 ml

-Meacutethode de Faust (1938) on centrifuge agrave 1500 tm une dilution des

selles dans lrsquoeau ordinaire tieacutede et on rejette le surnageant et on remet le

culot en suspension dans drsquoeau On reacutepegravete lrsquoopeacuteration jusqursquoagrave ce que le

surnageant soit limpide on remet alors le culot en suspension dans le

sulfate de Zink agrave 33 Apreacutes centrifugation on preacutelegraveve agrave lrsquoanse de

platine la pellicule de surfase qursquoon examine au microscope

- Meacutethode drsquoOtto Hwitt et Straham (1941) on procegravede de la meme

maniere que pour le Willis mais avec une solution aqueuse de sulfate

de Zink agrave 33 D=118

Avantage -Technique simple

-Mateacuteriel rudimentaire

- reacutealisation en seacuterie

-Sensibiliteacute treacutes bonne++++

Inconveacutenient

-Elle a ce pendant lrsquoinconveacutenient drsquoalteacuterer des Larves et les

Kystes pour les quels elle est contre-indiqueacutee ( reactifs

hypertoniques) de mecircme que pour les selles liquides ou

riches en lipides

-Elle donne de bons reacutesultats pour les oeufs drsquohelminthes

leacutegers (oeufs drsquoHymenolepis drsquoAnkylostome et deTaelignia)

B-Techniques de seacutedimentation bullLe diluant a une densiteacute inferieure agrave celle du

parasite alors se dernier se seacutedimente

Les principales techniques

- Meacutethode par seacutedimentation simple

- Meacutethode de Faust et IngallsReacutealiseacutee en utilisant

lrsquoeau glyceacuterineacutee (Eau + Glyceacuterine agrave 05) elle

permet drsquoaugmenter la mouillabiliteacute qui facilite la

seacutedimentation des parasites larves Anguillules

Œufs drsquoAscaris non feacutecondeacutes et œufs de

Schistosoma mansoni

-Meacutethode de Baroody et MostSeacutedimentation

centrifugation Eau de robinet chauffeacutee agrave 42degC

- Meacutethode de Jahnes et Hodges

Avantage -Technique simple

-Mateacuteriel rudimentaire

- reacutealisation en seacuterie

- Traitent une grande masse feacutecale ( parasites rares ou irreacuteguliegraverere ment

repartis dans la selle)

Inconveacutenient -une technique longue agrave reacutealiser

-Les cellules veacutegeacutetales seacutedimentent aussi vite que les parasites (Preacutesence

de certains reacutesidus)

-Non indiqueacutes en routine (sensibiliteacute

moyenne++)

Meacutethodes physico-chimiques ou

Diphasiques Caracteacuteriseacutees par la mise en preacutesence de deux

phases non miscibles lrsquoune aqueuse et lrsquoautre

constitueacutee par lrsquoeacutether qui est un solvant des lipidesil

se creacutee un coefficient de partage entre ces deux

phases et la reacutepartition de chaque eacuteleacutement feacutecal dans

chacune drsquoelles sera isoleacutes en fonction de son pouvoir

hydrophile ou lipophile

Bailenger a montreacute que le pH de la solution eacutetait

leacuteleacutement deacuteterminant pour la plus ou moins grande

efficaciteacute dune technique selon le parasite rechercheacute

Principes theacuteoriques

-Les selles tritureacutees (meacutelange au dixiegraveme environ) dans la solution choisie - elle peut ecirctre preacutealablement passeacutee sur un tamis pour eacuteliminer les gros deacutebris

le filtrat est verseacute dans un tube agrave centrifuger agrave fond conique en le remplissant 13

deacutether de maniegravere agrave ce quil y ai 23 du meacutelange selle en laissant 1 cm pour

fermer le tube

- Lrsquoagiter pendant une minute

- La suspension eacutetheacutero-liquide obtenue est centrifugeacutee agrave une vitesse lente de

lordre de 1500 agrave 2000 toursminute pendant une agrave trois minutes

- Apregraves centrifugation les constituants de la suspension sont reacutepartis en quatre

Couches

- Deacutecoller la couche des reacutesidus lipophiles agrave laide dune baguette de verre

- Retourner le tube au dessus de leacutevier (en faisant couler de leau) ou dun bac agrave

deacutechets liquides

- Essuyer les parois du tube avec un coton tenu agrave la pince en laissant toujours le

tube avec louverture dirigeacutee vers le bas pour eacuteviter de souiller le culot avec les

reacutesidus

- Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique pour

remettre en suspension le culot qui sera examineacute

- le culot qui nous inteacuteresse qui contient les eacuteleacutement parasitaires (kystes des

protozoaires)

Ether Debris

Phase aqueuse

Le culot

Les meacutethodes diphasiques sont

-Meacutethode de Telmann 1908

-Meacutethode De Rivas 1928

-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917

-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946

-Meacutethode De Ritchie 1948

-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood

-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf

-Meacutethode De Roman 1957

-Meacutethode de Bailenger 1962-1963

-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle

-Meacutethode de Junod 1927

Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage

Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia

Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)

La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble

lors de la centrifugation ce qui est un argument

diagnostique inteacuteressant

- Inconveacutenients

Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve

restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave

deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses

- Deacuteroulement de la technique

acide aceacutetique cristallisable 5 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethode de Bailenger - Avantages

Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et

des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5

(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)

- Inconveacutenients

Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre

technique est neacutecessaire

- Deacuteroulement de la technique

aceacutetate de sodium 15 g

acide aceacutetique 36 ml

eau distilleacutee qsp 1000 ml

Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide

dun pH-megravetre

Meacutethode de Ritchie simplifieacutee

- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles

formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour

enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les

oeufs dascaris et de schistosome

- Inconveacutenients

Le culot souvent volumineux est de lecture difficile

- Deacuteroulement de la technique

- Solutions de Ritchie

eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt

eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)

Meacutethode de Blagg et al

-Avantages

-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire

les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de

liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de

mercure souille les effluents du laboratoire

- Deacuteroulement de la technique

Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou

additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est

verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation

eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes

Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)

permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute

Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et

recommencer lagitation

On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et

cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee

Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages

-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles

Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes

aiseacutement et facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de

schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue

que les techniques en un temps

- Deacuteroulement de la technique

A) NaCl 9 g

formol officinal 10 ml

eau qsp 1000 ml

B) acide citrique 100 g

formol officinal 20 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethodes combineacutees

Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et

par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande

quantiteacute de selles

Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les

rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des

formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale

- Inconveacutenients

Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez

mal - Deacuteroulement de la technique

A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml

formol officinal 100 ml

eau qsp 1 000 ml

B bromure de sodium cristalliseacute 622 g

eau distilleacutee 1000 ml

Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant

pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou

kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour

trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente

- Inconveacutenients

Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps

assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate

preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)

- Deacuteroulement de la technique

- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)

liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml

eau distilleacutee 334 ml

Concentration diphasique

(MIF ou Bailenger)

une solution de

sulfate de zinc

30 secondes agrave f v

dilueacute au quart avec ED

Examiner

Le culot

Examiner

Le culot

iodomercurate

de potassium

de densiteacute 15

dilueacute au quart avec ED

Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod

simplifieacutee) - Avantages

donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete

- Inconveacutenients

Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi

dune solution de iodomercurate

- Deacuteroulement de la technique

Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)

- aceacutetate de sodium 15 g

- acide aceacutetique cristallisable 20 ml

- formol 40 ml

-eau qsp 1000 ml

Solution B (densiteacute 140)

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 442 volumes

8 g de selles

50 ml de solution de NaCl agrave

85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min

Suspension homo

+Tamisage Examiner

Le culot

eacuteliminer

le surnageant

20 ml dune solution A

+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique

1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min

4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer

le surnageant

Examiner

Le culot

Meacutethode de seacutedimentation-flottation

pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves

- Inconveacutenients

Quand la teneur des selles en lipides est anormalement

eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de

graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique

Solution de densiteacute 135

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 520 volumes

la suspension feacutecale en

eau agrave 85 de NaCl

1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min

1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min

20 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacute

eacuteliminer

le surnageant

5 agrave 7 ml de solution diodomercurate

de potassium de densiteacute 135 20 ml deau

Examen du culot

Seacutedimentation-flottation au saccharose

pour protozoaires - Avantages

permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les

kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand

lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste

na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des

selles fixeacutees au MIF

- Inconveacutenients

Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et

flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De

plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre

que des sels de mercure sont encore utiliseacutes

-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose

saccharose 120 g

eau 200 ml

Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et

utiliser alors

saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml

Suspension homo

+Tamisage +

2 agrave 3 heures

50 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacutee

fraicircche

10 agrave 15 ml de la suspension

1800-2000 toursmin 90sec

rejeter le surnageant

L 1 en12humide

3 agrave 4 g de selles

Seacute

dim

en

tatio

n

8 agrave 10 ml de solution de saccharose

+ 05 ml de solution de chlorure

mercurique agrave 15 en ED

1000 toursmin 45 sec

deacutecanter le

surnageant

dans T2

L 2 en12humide

Flottation

T2 20 agrave 30 ml deau

2000 toursmin90 sec

L 3 en12humide

Preacutecipitation

Les colorations

utile en cas de doute lrsquoidentification des

kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces

des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires

coloreacutees

recommandeacutee pour la conservation de

mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre

laboratoire pour avis

indispensable pour le diagnostic de certains

parasites (Cryptosporides microsporides)

Meacutethodes de coloration rapides

(Colorations en tubes)

- Meacutethode de Bailenger et Faraggi

- Meacutethode de Sapro Lawless et

Strome

-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene

tamporeacute

-Meacutethode de Horkin

- Meacutethode de Sargeaut

-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero

Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de

Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-

formol Apregraves meacutelange

- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave

laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout

-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le

fond du tube

-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en

protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees

immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine

des noyaux est coloreacutee en brun par liode

Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent

donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol

sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement

leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes

- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou

directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension

de selles avec le colorant

Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des

protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux

apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs

jours

la coloration de Bailenger

Laisser pendant une nuit en contact

cristal violet 2 g

fuchsine basique 005 g

alcool agrave 95deg 20 ml

pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml

eau distilleacutee 100 ml

Coloration des frottis

Pour bien observer les structures nucleacuteaires et

garder des lames de reacutefeacuterence on

confectionne un frottis de selles humide et

eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en

- 3 temps fixation puis coloration puis

diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)

- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg

Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)

Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag

- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher

soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains

dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)

soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)

soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1

heure)

-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode

-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau

- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3

30 min agrave leacutetuve agrave 37deg

- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece

24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs

-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au

microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent

nettement

-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau

-Deacuteshydrater

-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est

poseacutee deacutefinitivement

- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les

trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure

des noyaux Les kystes apparaissent en bleu

pacircle avec des noyaux bien nets Cest une

technique facile agrave reacutealiser

- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible

- Plonger la lame dans le fixateur colorant de

Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures

- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au

baume de Canada ou au baume syntheacutetique

Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par

Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie

- Seacutechage

- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol

- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid

- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet

- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20

secondes en agitant

- Rinccedilage

-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5

- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100

- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert

Coloration des microscporidies

Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10

- Effectuer un frottis de la selle

- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de

meacutethanol

- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes

- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord

en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml

- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge

Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee

microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-

Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution

- Colorer pendant 3 heures

- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02

-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-

Rincer seacutecher et lire au grossissement x100

Coloration par Uvitex 2B

Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute

pour la chitine Met en eacutevidence les

microsporidie par une fluorescence

directe On obtient une

fluorescence bleue pale sur fond

noir

Scotch test anal ( test de Graham agrave

la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius

vermicularis ainsi que les anneaux ou les

oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors

de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est

appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant

toute toilette en position foetale ou genou

pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus

et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute

sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera

agrave lrsquoobjectif X10

NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les

parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que

la technique devra ecirctre faite avec des gants

ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite

pour eacuteviter la contamination par les oeufs

auto-infestant de lrsquooxyure

Meacutethodes speacuteciales

Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon

eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs

drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle

de la taille drsquoun petit pois

Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen

des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm

dans une quantiteacute de vert malachite agrave

3 (contre colorant) et de glyceacuterine

appliquer la bande sur la selle et sur la

lame renverser et appuyer sur la

paillasse

Methode de Kato-Katz quantitative

utilise un gabarie pour la selle

Meacutethode efficace pour la recherche

doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale

mais inutilisable pour les kytes et les

larves ainsi que les oeufs dankylostome

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

PRELEVEMENT

Nombre de preacutelegravevements

Une seul analyse ne permet de deacuteceler la preacutesense

drsquoeacuteleacutements parasitaires que dans 30 des cas

- Rareteacute des eacuteleacutements parasitaires

- Efficaciteacute des techniques utiliseacutees

-Une peacuteriode muette de rejet des eacutelements

caracteacuteristiques (giardiase amibiase)

Il faut dans lrsquoideal pratiquer trois

examens coprologiques agrave quelques

jours drsquointervalle pour affirmer la

neacutegativiteacute

Recueil des selles

-Reacutecipient propre et sec agrave bouchage hermeacutetique

-faire recueillir lrsquoensemble de lrsquoeacutemission

-etiquetage prescripteur nom du patient date

du preacutelegravevement et traitement observeacute si il existe

- les selles ne doit surtout pas ecirctre meacutelanger aux

urines (destruction des formes veacutegeacutetatives)

Deacutelai drsquoexamen

Il faut que la selle parvienne dans les plus brefs deacutelais au

laboratoire afin drsquoeacuteviter la deacutegeacuteneacuterescence des formes

veacutegeacutetatives des protozoaires qui sont sensible agrave la variation

de tempeacuteratures et agrave la deacuteshydratation

Techniques de conservation

Conservation provisoire par le froid (+4degC)

-Bonne conservation des kystes de protozoaires etou

œufs drsquohelminthes

-Mort rapide des trophozoites de protozoaire

-Mort les larves drsquoanguilules

Meacutethode agrave lrsquoeau formoleacutee ( fixation conservation)

-Aldehyde formique( formol) de 5 agrave 20

-Glyceacuterine( facultatif)

-Eau distilleacutee ou lrsquoeau physiologique 100ml La selle +

3 vol 1 vol

tamiser Sedimenter stoker

Bonne conservation œufs drsquohelminthe et kystes de

protozoaires tant que le preacutelegravevement reste liquide

Fixation au MIF (Merthiolate-Iode-Formol)

SOLUTION 1 de mercurothiolate iode

ndashformol

-teinture de mercurethiolate 200 ml

-glycerine 5 ml

-formol agrave 40 25 ml

-eau distilleacutee 250 ml

SOLUTION 2 de Lugol

-iode 05 g

-iode de potassium 1g

-eau distilleacutee 10 ml

1175 ml 075ml +

3 agrave 5 g selles

Triturer stoker

Conservation beaucoups plus longue des

formes veacutegeacutetatives et les kystes de protozoaires

Meacutelange fixateur agrave lrsquoalcool polyvinylique APV

APV

-alcool polyvinylique en poudre

5g

-glyceacuterol 15ml

-eau distilleacutee 625 ml

un bain marie ( 70 -75degC)10mn

Fixateur de Schaudinn modifieacute

-cristaux de clorure de mercure HgCl2

15g

-ethanol agrave 95 31 ml

Acide aceacutetique glacial 5ml +

2 agrave 3 mn

-Bonne conservation

-Une fixtion permettant de pratiquer des

frottis pouvant etre coloreacutes

Concervation des vers

Neacutematotes

Treacutematodes

cestodes

+ eau physiologique Entre 2 lames

Plongeacutes dan un fixteur

Ex - alcool 70 bouillant

- meacutelange alcool et formol

Aspect normal de la selle - poids de 110 agrave 150 g

- couleur brune

- Une consistance ferme et un aspect mouleacute

-- Un pH drsquoenviron 7

Microscopiquement en doit observeacute

-- Des fibres musculaires

-- De la cellulose non digestible poils vaisseaux

ligneux eacuteleacutements scleacutereux

-- de lrsquoamidon si le reacutegime est riche en feacuteculents et chez

lrsquoenfant

-- Quelques masses amorphes ou disques radieacutes ( les

savons)

-- il ne doit pas avoir de globules gras ( graisses

neutres)

COPROLOGIE PARASITAIRE Conduite de lrsquoexamen

1048766 Examen macroscopique

1048766 Examen microscopique

- Examen direct sans concentration

- Examen direct apreacutes concentration

- Les meacutethodes physiques

- Techniques de flottation

- Techniques de seacutedimentation

- Les meacutethodes physico-chimiques

- Les meacutethodes combineacutees

-Colorations speacutecifiques

- cultures

- Examens particuliers

Lrsquoobservation macroscopique Il permet de noter

- Couleur ( brune jaune ou ocre verte

deacutecoloreacutee noire rouge)

- consistance (molle dure liquide)

- aspect (preacutesence de bulles ou de gras

steacuteatorrheacutee)

- Preacutesence drsquoeacuteleacutements surajouteacutes

-Parasites adulte drsquoAscaris femelle drsquooxuyre

anneau ou chaine de taenia

-glaire (mucus)

-sang de pus

Lrsquoexamen direct sans concentration -Lexamen direct est le seule examen qui permet drsquoappreacutecier la vitaliteacute des

parasites

-Il met en eacutevidence les kystes et les formes veacutegeacutetatives de protozoaires ainsi

quelques oeufs et les larves dhelminthes

- On peut rajouter du Lugol double sur la lame qui fixe et colore les

structure nucleacuteaires

- Quelque soit le reacutesultat de lrsquoexamen direct on doit obligatoirement le

compleacuteter par deux techniques de concentration lrsquoune pour les kystes et

lrsquoautre pour les oeufs

- Il est impeacuteratif de connaitre la deacutescription des eacuteleacutements parasitaire et

de retenir les possibles faux parasites

Lrsquoobservation microscopique

une noisette de selle

(agrave diffeacuterents endroits)

lrsquoeau physiologique

agrave 09

suspension homogegravene

2 gouttes sur une

lame recouvrir par

une lamelle

lecture en

zig-zag x10

x 40

+

Les meacutethodes de concentrations

Les techniques par lesquelles on

essaie agrave partir de la grande quantiteacute

de la matieres feacutecales recueillies

drsquoobtenir dans un faible volume les

œufs larves kystes voire formes

veacutegeacutetatifs fixeacutees de parasites par

eacutelimination des reacutesidus de la

digestion

Les meacutethodes physiques

Les selles dilueacutees dans un reacuteactif de densiteacute

diffeacuterente de celle de parasite

DR superieur DP = flottation

DR inferieur DP = seacutedimentation

A-Techniques de flottation

Crsquoest une technique part du principe que la densiteacute du liquide et supeacuterieur

agrave celle des parasites ces derniers plus leacutegers flottent agrave la surface

Les principales techniques de flottation

- Meacutethode de Fullborn (1920) elle utilise une solution satureacutee de NaCl

(NaCl 250g ED 750ml d=12)

- Meacutethode de Willis (1921) simple et utilisable en routine

bullDiluer une noisette de selle dans la solution satureacutee de NaCl agrave 25

bullRemplissez un tube en verre conique jusquagrave sonbord en formant un

meacutenisque concave (verre de montre) sur lequel on deacutepose une lamelle

pendant 15 minutes (pas plus pour eacuteviter la cristalisation des oeufs) On la

deacutepose ensuite sur une lame porte objet et on observe agrave lrsquoobjectif X10 agrave la

recherche des OEufs drsquohelminthes tels que ceux drsquoHymenolepis ou

drsquoAnkylstomes

-Meacutethode de Janeckso et Urbanyi(1931) utilise comme reacuteactif une

solution de domercurate de potassium ( d=114) qui doit etre manipuleacutee

avec prudence

Iodo-mercurate de potassium

Bi iodure de mercure 100g

Iodure de potassium 74g

Eau distilleacutee 50 ml

-Meacutethode de Faust (1938) on centrifuge agrave 1500 tm une dilution des

selles dans lrsquoeau ordinaire tieacutede et on rejette le surnageant et on remet le

culot en suspension dans drsquoeau On reacutepegravete lrsquoopeacuteration jusqursquoagrave ce que le

surnageant soit limpide on remet alors le culot en suspension dans le

sulfate de Zink agrave 33 Apreacutes centrifugation on preacutelegraveve agrave lrsquoanse de

platine la pellicule de surfase qursquoon examine au microscope

- Meacutethode drsquoOtto Hwitt et Straham (1941) on procegravede de la meme

maniere que pour le Willis mais avec une solution aqueuse de sulfate

de Zink agrave 33 D=118

Avantage -Technique simple

-Mateacuteriel rudimentaire

- reacutealisation en seacuterie

-Sensibiliteacute treacutes bonne++++

Inconveacutenient

-Elle a ce pendant lrsquoinconveacutenient drsquoalteacuterer des Larves et les

Kystes pour les quels elle est contre-indiqueacutee ( reactifs

hypertoniques) de mecircme que pour les selles liquides ou

riches en lipides

-Elle donne de bons reacutesultats pour les oeufs drsquohelminthes

leacutegers (oeufs drsquoHymenolepis drsquoAnkylostome et deTaelignia)

B-Techniques de seacutedimentation bullLe diluant a une densiteacute inferieure agrave celle du

parasite alors se dernier se seacutedimente

Les principales techniques

- Meacutethode par seacutedimentation simple

- Meacutethode de Faust et IngallsReacutealiseacutee en utilisant

lrsquoeau glyceacuterineacutee (Eau + Glyceacuterine agrave 05) elle

permet drsquoaugmenter la mouillabiliteacute qui facilite la

seacutedimentation des parasites larves Anguillules

Œufs drsquoAscaris non feacutecondeacutes et œufs de

Schistosoma mansoni

-Meacutethode de Baroody et MostSeacutedimentation

centrifugation Eau de robinet chauffeacutee agrave 42degC

- Meacutethode de Jahnes et Hodges

Avantage -Technique simple

-Mateacuteriel rudimentaire

- reacutealisation en seacuterie

- Traitent une grande masse feacutecale ( parasites rares ou irreacuteguliegraverere ment

repartis dans la selle)

Inconveacutenient -une technique longue agrave reacutealiser

-Les cellules veacutegeacutetales seacutedimentent aussi vite que les parasites (Preacutesence

de certains reacutesidus)

-Non indiqueacutes en routine (sensibiliteacute

moyenne++)

Meacutethodes physico-chimiques ou

Diphasiques Caracteacuteriseacutees par la mise en preacutesence de deux

phases non miscibles lrsquoune aqueuse et lrsquoautre

constitueacutee par lrsquoeacutether qui est un solvant des lipidesil

se creacutee un coefficient de partage entre ces deux

phases et la reacutepartition de chaque eacuteleacutement feacutecal dans

chacune drsquoelles sera isoleacutes en fonction de son pouvoir

hydrophile ou lipophile

Bailenger a montreacute que le pH de la solution eacutetait

leacuteleacutement deacuteterminant pour la plus ou moins grande

efficaciteacute dune technique selon le parasite rechercheacute

Principes theacuteoriques

-Les selles tritureacutees (meacutelange au dixiegraveme environ) dans la solution choisie - elle peut ecirctre preacutealablement passeacutee sur un tamis pour eacuteliminer les gros deacutebris

le filtrat est verseacute dans un tube agrave centrifuger agrave fond conique en le remplissant 13

deacutether de maniegravere agrave ce quil y ai 23 du meacutelange selle en laissant 1 cm pour

fermer le tube

- Lrsquoagiter pendant une minute

- La suspension eacutetheacutero-liquide obtenue est centrifugeacutee agrave une vitesse lente de

lordre de 1500 agrave 2000 toursminute pendant une agrave trois minutes

- Apregraves centrifugation les constituants de la suspension sont reacutepartis en quatre

Couches

- Deacutecoller la couche des reacutesidus lipophiles agrave laide dune baguette de verre

- Retourner le tube au dessus de leacutevier (en faisant couler de leau) ou dun bac agrave

deacutechets liquides

- Essuyer les parois du tube avec un coton tenu agrave la pince en laissant toujours le

tube avec louverture dirigeacutee vers le bas pour eacuteviter de souiller le culot avec les

reacutesidus

- Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique pour

remettre en suspension le culot qui sera examineacute

- le culot qui nous inteacuteresse qui contient les eacuteleacutement parasitaires (kystes des

protozoaires)

Ether Debris

Phase aqueuse

Le culot

Les meacutethodes diphasiques sont

-Meacutethode de Telmann 1908

-Meacutethode De Rivas 1928

-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917

-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946

-Meacutethode De Ritchie 1948

-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood

-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf

-Meacutethode De Roman 1957

-Meacutethode de Bailenger 1962-1963

-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle

-Meacutethode de Junod 1927

Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage

Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia

Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)

La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble

lors de la centrifugation ce qui est un argument

diagnostique inteacuteressant

- Inconveacutenients

Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve

restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave

deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses

- Deacuteroulement de la technique

acide aceacutetique cristallisable 5 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethode de Bailenger - Avantages

Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et

des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5

(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)

- Inconveacutenients

Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre

technique est neacutecessaire

- Deacuteroulement de la technique

aceacutetate de sodium 15 g

acide aceacutetique 36 ml

eau distilleacutee qsp 1000 ml

Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide

dun pH-megravetre

Meacutethode de Ritchie simplifieacutee

- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles

formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour

enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les

oeufs dascaris et de schistosome

- Inconveacutenients

Le culot souvent volumineux est de lecture difficile

- Deacuteroulement de la technique

- Solutions de Ritchie

eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt

eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)

Meacutethode de Blagg et al

-Avantages

-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire

les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de

liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de

mercure souille les effluents du laboratoire

- Deacuteroulement de la technique

Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou

additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est

verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation

eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes

Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)

permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute

Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et

recommencer lagitation

On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et

cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee

Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages

-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles

Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes

aiseacutement et facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de

schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue

que les techniques en un temps

- Deacuteroulement de la technique

A) NaCl 9 g

formol officinal 10 ml

eau qsp 1000 ml

B) acide citrique 100 g

formol officinal 20 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethodes combineacutees

Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et

par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande

quantiteacute de selles

Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les

rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des

formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale

- Inconveacutenients

Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez

mal - Deacuteroulement de la technique

A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml

formol officinal 100 ml

eau qsp 1 000 ml

B bromure de sodium cristalliseacute 622 g

eau distilleacutee 1000 ml

Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant

pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou

kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour

trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente

- Inconveacutenients

Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps

assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate

preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)

- Deacuteroulement de la technique

- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)

liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml

eau distilleacutee 334 ml

Concentration diphasique

(MIF ou Bailenger)

une solution de

sulfate de zinc

30 secondes agrave f v

dilueacute au quart avec ED

Examiner

Le culot

Examiner

Le culot

iodomercurate

de potassium

de densiteacute 15

dilueacute au quart avec ED

Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod

simplifieacutee) - Avantages

donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete

- Inconveacutenients

Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi

dune solution de iodomercurate

- Deacuteroulement de la technique

Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)

- aceacutetate de sodium 15 g

- acide aceacutetique cristallisable 20 ml

- formol 40 ml

-eau qsp 1000 ml

Solution B (densiteacute 140)

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 442 volumes

8 g de selles

50 ml de solution de NaCl agrave

85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min

Suspension homo

+Tamisage Examiner

Le culot

eacuteliminer

le surnageant

20 ml dune solution A

+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique

1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min

4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer

le surnageant

Examiner

Le culot

Meacutethode de seacutedimentation-flottation

pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves

- Inconveacutenients

Quand la teneur des selles en lipides est anormalement

eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de

graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique

Solution de densiteacute 135

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 520 volumes

la suspension feacutecale en

eau agrave 85 de NaCl

1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min

1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min

20 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacute

eacuteliminer

le surnageant

5 agrave 7 ml de solution diodomercurate

de potassium de densiteacute 135 20 ml deau

Examen du culot

Seacutedimentation-flottation au saccharose

pour protozoaires - Avantages

permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les

kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand

lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste

na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des

selles fixeacutees au MIF

- Inconveacutenients

Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et

flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De

plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre

que des sels de mercure sont encore utiliseacutes

-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose

saccharose 120 g

eau 200 ml

Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et

utiliser alors

saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml

Suspension homo

+Tamisage +

2 agrave 3 heures

50 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacutee

fraicircche

10 agrave 15 ml de la suspension

1800-2000 toursmin 90sec

rejeter le surnageant

L 1 en12humide

3 agrave 4 g de selles

Seacute

dim

en

tatio

n

8 agrave 10 ml de solution de saccharose

+ 05 ml de solution de chlorure

mercurique agrave 15 en ED

1000 toursmin 45 sec

deacutecanter le

surnageant

dans T2

L 2 en12humide

Flottation

T2 20 agrave 30 ml deau

2000 toursmin90 sec

L 3 en12humide

Preacutecipitation

Les colorations

utile en cas de doute lrsquoidentification des

kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces

des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires

coloreacutees

recommandeacutee pour la conservation de

mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre

laboratoire pour avis

indispensable pour le diagnostic de certains

parasites (Cryptosporides microsporides)

Meacutethodes de coloration rapides

(Colorations en tubes)

- Meacutethode de Bailenger et Faraggi

- Meacutethode de Sapro Lawless et

Strome

-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene

tamporeacute

-Meacutethode de Horkin

- Meacutethode de Sargeaut

-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero

Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de

Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-

formol Apregraves meacutelange

- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave

laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout

-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le

fond du tube

-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en

protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees

immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine

des noyaux est coloreacutee en brun par liode

Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent

donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol

sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement

leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes

- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou

directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension

de selles avec le colorant

Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des

protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux

apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs

jours

la coloration de Bailenger

Laisser pendant une nuit en contact

cristal violet 2 g

fuchsine basique 005 g

alcool agrave 95deg 20 ml

pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml

eau distilleacutee 100 ml

Coloration des frottis

Pour bien observer les structures nucleacuteaires et

garder des lames de reacutefeacuterence on

confectionne un frottis de selles humide et

eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en

- 3 temps fixation puis coloration puis

diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)

- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg

Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)

Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag

- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher

soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains

dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)

soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)

soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1

heure)

-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode

-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau

- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3

30 min agrave leacutetuve agrave 37deg

- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece

24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs

-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au

microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent

nettement

-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau

-Deacuteshydrater

-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est

poseacutee deacutefinitivement

- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les

trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure

des noyaux Les kystes apparaissent en bleu

pacircle avec des noyaux bien nets Cest une

technique facile agrave reacutealiser

- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible

- Plonger la lame dans le fixateur colorant de

Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures

- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au

baume de Canada ou au baume syntheacutetique

Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par

Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie

- Seacutechage

- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol

- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid

- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet

- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20

secondes en agitant

- Rinccedilage

-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5

- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100

- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert

Coloration des microscporidies

Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10

- Effectuer un frottis de la selle

- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de

meacutethanol

- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes

- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord

en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml

- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge

Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee

microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-

Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution

- Colorer pendant 3 heures

- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02

-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-

Rincer seacutecher et lire au grossissement x100

Coloration par Uvitex 2B

Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute

pour la chitine Met en eacutevidence les

microsporidie par une fluorescence

directe On obtient une

fluorescence bleue pale sur fond

noir

Scotch test anal ( test de Graham agrave

la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius

vermicularis ainsi que les anneaux ou les

oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors

de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est

appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant

toute toilette en position foetale ou genou

pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus

et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute

sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera

agrave lrsquoobjectif X10

NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les

parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que

la technique devra ecirctre faite avec des gants

ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite

pour eacuteviter la contamination par les oeufs

auto-infestant de lrsquooxyure

Meacutethodes speacuteciales

Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon

eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs

drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle

de la taille drsquoun petit pois

Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen

des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm

dans une quantiteacute de vert malachite agrave

3 (contre colorant) et de glyceacuterine

appliquer la bande sur la selle et sur la

lame renverser et appuyer sur la

paillasse

Methode de Kato-Katz quantitative

utilise un gabarie pour la selle

Meacutethode efficace pour la recherche

doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale

mais inutilisable pour les kytes et les

larves ainsi que les oeufs dankylostome

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

Recueil des selles

-Reacutecipient propre et sec agrave bouchage hermeacutetique

-faire recueillir lrsquoensemble de lrsquoeacutemission

-etiquetage prescripteur nom du patient date

du preacutelegravevement et traitement observeacute si il existe

- les selles ne doit surtout pas ecirctre meacutelanger aux

urines (destruction des formes veacutegeacutetatives)

Deacutelai drsquoexamen

Il faut que la selle parvienne dans les plus brefs deacutelais au

laboratoire afin drsquoeacuteviter la deacutegeacuteneacuterescence des formes

veacutegeacutetatives des protozoaires qui sont sensible agrave la variation

de tempeacuteratures et agrave la deacuteshydratation

Techniques de conservation

Conservation provisoire par le froid (+4degC)

-Bonne conservation des kystes de protozoaires etou

œufs drsquohelminthes

-Mort rapide des trophozoites de protozoaire

-Mort les larves drsquoanguilules

Meacutethode agrave lrsquoeau formoleacutee ( fixation conservation)

-Aldehyde formique( formol) de 5 agrave 20

-Glyceacuterine( facultatif)

-Eau distilleacutee ou lrsquoeau physiologique 100ml La selle +

3 vol 1 vol

tamiser Sedimenter stoker

Bonne conservation œufs drsquohelminthe et kystes de

protozoaires tant que le preacutelegravevement reste liquide

Fixation au MIF (Merthiolate-Iode-Formol)

SOLUTION 1 de mercurothiolate iode

ndashformol

-teinture de mercurethiolate 200 ml

-glycerine 5 ml

-formol agrave 40 25 ml

-eau distilleacutee 250 ml

SOLUTION 2 de Lugol

-iode 05 g

-iode de potassium 1g

-eau distilleacutee 10 ml

1175 ml 075ml +

3 agrave 5 g selles

Triturer stoker

Conservation beaucoups plus longue des

formes veacutegeacutetatives et les kystes de protozoaires

Meacutelange fixateur agrave lrsquoalcool polyvinylique APV

APV

-alcool polyvinylique en poudre

5g

-glyceacuterol 15ml

-eau distilleacutee 625 ml

un bain marie ( 70 -75degC)10mn

Fixateur de Schaudinn modifieacute

-cristaux de clorure de mercure HgCl2

15g

-ethanol agrave 95 31 ml

Acide aceacutetique glacial 5ml +

2 agrave 3 mn

-Bonne conservation

-Une fixtion permettant de pratiquer des

frottis pouvant etre coloreacutes

Concervation des vers

Neacutematotes

Treacutematodes

cestodes

+ eau physiologique Entre 2 lames

Plongeacutes dan un fixteur

Ex - alcool 70 bouillant

- meacutelange alcool et formol

Aspect normal de la selle - poids de 110 agrave 150 g

- couleur brune

- Une consistance ferme et un aspect mouleacute

-- Un pH drsquoenviron 7

Microscopiquement en doit observeacute

-- Des fibres musculaires

-- De la cellulose non digestible poils vaisseaux

ligneux eacuteleacutements scleacutereux

-- de lrsquoamidon si le reacutegime est riche en feacuteculents et chez

lrsquoenfant

-- Quelques masses amorphes ou disques radieacutes ( les

savons)

-- il ne doit pas avoir de globules gras ( graisses

neutres)

COPROLOGIE PARASITAIRE Conduite de lrsquoexamen

1048766 Examen macroscopique

1048766 Examen microscopique

- Examen direct sans concentration

- Examen direct apreacutes concentration

- Les meacutethodes physiques

- Techniques de flottation

- Techniques de seacutedimentation

- Les meacutethodes physico-chimiques

- Les meacutethodes combineacutees

-Colorations speacutecifiques

- cultures

- Examens particuliers

Lrsquoobservation macroscopique Il permet de noter

- Couleur ( brune jaune ou ocre verte

deacutecoloreacutee noire rouge)

- consistance (molle dure liquide)

- aspect (preacutesence de bulles ou de gras

steacuteatorrheacutee)

- Preacutesence drsquoeacuteleacutements surajouteacutes

-Parasites adulte drsquoAscaris femelle drsquooxuyre

anneau ou chaine de taenia

-glaire (mucus)

-sang de pus

Lrsquoexamen direct sans concentration -Lexamen direct est le seule examen qui permet drsquoappreacutecier la vitaliteacute des

parasites

-Il met en eacutevidence les kystes et les formes veacutegeacutetatives de protozoaires ainsi

quelques oeufs et les larves dhelminthes

- On peut rajouter du Lugol double sur la lame qui fixe et colore les

structure nucleacuteaires

- Quelque soit le reacutesultat de lrsquoexamen direct on doit obligatoirement le

compleacuteter par deux techniques de concentration lrsquoune pour les kystes et

lrsquoautre pour les oeufs

- Il est impeacuteratif de connaitre la deacutescription des eacuteleacutements parasitaire et

de retenir les possibles faux parasites

Lrsquoobservation microscopique

une noisette de selle

(agrave diffeacuterents endroits)

lrsquoeau physiologique

agrave 09

suspension homogegravene

2 gouttes sur une

lame recouvrir par

une lamelle

lecture en

zig-zag x10

x 40

+

Les meacutethodes de concentrations

Les techniques par lesquelles on

essaie agrave partir de la grande quantiteacute

de la matieres feacutecales recueillies

drsquoobtenir dans un faible volume les

œufs larves kystes voire formes

veacutegeacutetatifs fixeacutees de parasites par

eacutelimination des reacutesidus de la

digestion

Les meacutethodes physiques

Les selles dilueacutees dans un reacuteactif de densiteacute

diffeacuterente de celle de parasite

DR superieur DP = flottation

DR inferieur DP = seacutedimentation

A-Techniques de flottation

Crsquoest une technique part du principe que la densiteacute du liquide et supeacuterieur

agrave celle des parasites ces derniers plus leacutegers flottent agrave la surface

Les principales techniques de flottation

- Meacutethode de Fullborn (1920) elle utilise une solution satureacutee de NaCl

(NaCl 250g ED 750ml d=12)

- Meacutethode de Willis (1921) simple et utilisable en routine

bullDiluer une noisette de selle dans la solution satureacutee de NaCl agrave 25

bullRemplissez un tube en verre conique jusquagrave sonbord en formant un

meacutenisque concave (verre de montre) sur lequel on deacutepose une lamelle

pendant 15 minutes (pas plus pour eacuteviter la cristalisation des oeufs) On la

deacutepose ensuite sur une lame porte objet et on observe agrave lrsquoobjectif X10 agrave la

recherche des OEufs drsquohelminthes tels que ceux drsquoHymenolepis ou

drsquoAnkylstomes

-Meacutethode de Janeckso et Urbanyi(1931) utilise comme reacuteactif une

solution de domercurate de potassium ( d=114) qui doit etre manipuleacutee

avec prudence

Iodo-mercurate de potassium

Bi iodure de mercure 100g

Iodure de potassium 74g

Eau distilleacutee 50 ml

-Meacutethode de Faust (1938) on centrifuge agrave 1500 tm une dilution des

selles dans lrsquoeau ordinaire tieacutede et on rejette le surnageant et on remet le

culot en suspension dans drsquoeau On reacutepegravete lrsquoopeacuteration jusqursquoagrave ce que le

surnageant soit limpide on remet alors le culot en suspension dans le

sulfate de Zink agrave 33 Apreacutes centrifugation on preacutelegraveve agrave lrsquoanse de

platine la pellicule de surfase qursquoon examine au microscope

- Meacutethode drsquoOtto Hwitt et Straham (1941) on procegravede de la meme

maniere que pour le Willis mais avec une solution aqueuse de sulfate

de Zink agrave 33 D=118

Avantage -Technique simple

-Mateacuteriel rudimentaire

- reacutealisation en seacuterie

-Sensibiliteacute treacutes bonne++++

Inconveacutenient

-Elle a ce pendant lrsquoinconveacutenient drsquoalteacuterer des Larves et les

Kystes pour les quels elle est contre-indiqueacutee ( reactifs

hypertoniques) de mecircme que pour les selles liquides ou

riches en lipides

-Elle donne de bons reacutesultats pour les oeufs drsquohelminthes

leacutegers (oeufs drsquoHymenolepis drsquoAnkylostome et deTaelignia)

B-Techniques de seacutedimentation bullLe diluant a une densiteacute inferieure agrave celle du

parasite alors se dernier se seacutedimente

Les principales techniques

- Meacutethode par seacutedimentation simple

- Meacutethode de Faust et IngallsReacutealiseacutee en utilisant

lrsquoeau glyceacuterineacutee (Eau + Glyceacuterine agrave 05) elle

permet drsquoaugmenter la mouillabiliteacute qui facilite la

seacutedimentation des parasites larves Anguillules

Œufs drsquoAscaris non feacutecondeacutes et œufs de

Schistosoma mansoni

-Meacutethode de Baroody et MostSeacutedimentation

centrifugation Eau de robinet chauffeacutee agrave 42degC

- Meacutethode de Jahnes et Hodges

Avantage -Technique simple

-Mateacuteriel rudimentaire

- reacutealisation en seacuterie

- Traitent une grande masse feacutecale ( parasites rares ou irreacuteguliegraverere ment

repartis dans la selle)

Inconveacutenient -une technique longue agrave reacutealiser

-Les cellules veacutegeacutetales seacutedimentent aussi vite que les parasites (Preacutesence

de certains reacutesidus)

-Non indiqueacutes en routine (sensibiliteacute

moyenne++)

Meacutethodes physico-chimiques ou

Diphasiques Caracteacuteriseacutees par la mise en preacutesence de deux

phases non miscibles lrsquoune aqueuse et lrsquoautre

constitueacutee par lrsquoeacutether qui est un solvant des lipidesil

se creacutee un coefficient de partage entre ces deux

phases et la reacutepartition de chaque eacuteleacutement feacutecal dans

chacune drsquoelles sera isoleacutes en fonction de son pouvoir

hydrophile ou lipophile

Bailenger a montreacute que le pH de la solution eacutetait

leacuteleacutement deacuteterminant pour la plus ou moins grande

efficaciteacute dune technique selon le parasite rechercheacute

Principes theacuteoriques

-Les selles tritureacutees (meacutelange au dixiegraveme environ) dans la solution choisie - elle peut ecirctre preacutealablement passeacutee sur un tamis pour eacuteliminer les gros deacutebris

le filtrat est verseacute dans un tube agrave centrifuger agrave fond conique en le remplissant 13

deacutether de maniegravere agrave ce quil y ai 23 du meacutelange selle en laissant 1 cm pour

fermer le tube

- Lrsquoagiter pendant une minute

- La suspension eacutetheacutero-liquide obtenue est centrifugeacutee agrave une vitesse lente de

lordre de 1500 agrave 2000 toursminute pendant une agrave trois minutes

- Apregraves centrifugation les constituants de la suspension sont reacutepartis en quatre

Couches

- Deacutecoller la couche des reacutesidus lipophiles agrave laide dune baguette de verre

- Retourner le tube au dessus de leacutevier (en faisant couler de leau) ou dun bac agrave

deacutechets liquides

- Essuyer les parois du tube avec un coton tenu agrave la pince en laissant toujours le

tube avec louverture dirigeacutee vers le bas pour eacuteviter de souiller le culot avec les

reacutesidus

- Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique pour

remettre en suspension le culot qui sera examineacute

- le culot qui nous inteacuteresse qui contient les eacuteleacutement parasitaires (kystes des

protozoaires)

Ether Debris

Phase aqueuse

Le culot

Les meacutethodes diphasiques sont

-Meacutethode de Telmann 1908

-Meacutethode De Rivas 1928

-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917

-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946

-Meacutethode De Ritchie 1948

-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood

-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf

-Meacutethode De Roman 1957

-Meacutethode de Bailenger 1962-1963

-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle

-Meacutethode de Junod 1927

Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage

Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia

Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)

La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble

lors de la centrifugation ce qui est un argument

diagnostique inteacuteressant

- Inconveacutenients

Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve

restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave

deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses

- Deacuteroulement de la technique

acide aceacutetique cristallisable 5 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethode de Bailenger - Avantages

Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et

des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5

(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)

- Inconveacutenients

Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre

technique est neacutecessaire

- Deacuteroulement de la technique

aceacutetate de sodium 15 g

acide aceacutetique 36 ml

eau distilleacutee qsp 1000 ml

Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide

dun pH-megravetre

Meacutethode de Ritchie simplifieacutee

- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles

formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour

enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les

oeufs dascaris et de schistosome

- Inconveacutenients

Le culot souvent volumineux est de lecture difficile

- Deacuteroulement de la technique

- Solutions de Ritchie

eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt

eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)

Meacutethode de Blagg et al

-Avantages

-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire

les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de

liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de

mercure souille les effluents du laboratoire

- Deacuteroulement de la technique

Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou

additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est

verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation

eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes

Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)

permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute

Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et

recommencer lagitation

On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et

cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee

Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages

-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles

Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes

aiseacutement et facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de

schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue

que les techniques en un temps

- Deacuteroulement de la technique

A) NaCl 9 g

formol officinal 10 ml

eau qsp 1000 ml

B) acide citrique 100 g

formol officinal 20 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethodes combineacutees

Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et

par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande

quantiteacute de selles

Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les

rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des

formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale

- Inconveacutenients

Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez

mal - Deacuteroulement de la technique

A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml

formol officinal 100 ml

eau qsp 1 000 ml

B bromure de sodium cristalliseacute 622 g

eau distilleacutee 1000 ml

Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant

pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou

kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour

trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente

- Inconveacutenients

Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps

assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate

preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)

- Deacuteroulement de la technique

- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)

liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml

eau distilleacutee 334 ml

Concentration diphasique

(MIF ou Bailenger)

une solution de

sulfate de zinc

30 secondes agrave f v

dilueacute au quart avec ED

Examiner

Le culot

Examiner

Le culot

iodomercurate

de potassium

de densiteacute 15

dilueacute au quart avec ED

Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod

simplifieacutee) - Avantages

donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete

- Inconveacutenients

Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi

dune solution de iodomercurate

- Deacuteroulement de la technique

Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)

- aceacutetate de sodium 15 g

- acide aceacutetique cristallisable 20 ml

- formol 40 ml

-eau qsp 1000 ml

Solution B (densiteacute 140)

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 442 volumes

8 g de selles

50 ml de solution de NaCl agrave

85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min

Suspension homo

+Tamisage Examiner

Le culot

eacuteliminer

le surnageant

20 ml dune solution A

+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique

1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min

4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer

le surnageant

Examiner

Le culot

Meacutethode de seacutedimentation-flottation

pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves

- Inconveacutenients

Quand la teneur des selles en lipides est anormalement

eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de

graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique

Solution de densiteacute 135

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 520 volumes

la suspension feacutecale en

eau agrave 85 de NaCl

1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min

1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min

20 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacute

eacuteliminer

le surnageant

5 agrave 7 ml de solution diodomercurate

de potassium de densiteacute 135 20 ml deau

Examen du culot

Seacutedimentation-flottation au saccharose

pour protozoaires - Avantages

permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les

kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand

lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste

na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des

selles fixeacutees au MIF

- Inconveacutenients

Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et

flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De

plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre

que des sels de mercure sont encore utiliseacutes

-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose

saccharose 120 g

eau 200 ml

Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et

utiliser alors

saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml

Suspension homo

+Tamisage +

2 agrave 3 heures

50 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacutee

fraicircche

10 agrave 15 ml de la suspension

1800-2000 toursmin 90sec

rejeter le surnageant

L 1 en12humide

3 agrave 4 g de selles

Seacute

dim

en

tatio

n

8 agrave 10 ml de solution de saccharose

+ 05 ml de solution de chlorure

mercurique agrave 15 en ED

1000 toursmin 45 sec

deacutecanter le

surnageant

dans T2

L 2 en12humide

Flottation

T2 20 agrave 30 ml deau

2000 toursmin90 sec

L 3 en12humide

Preacutecipitation

Les colorations

utile en cas de doute lrsquoidentification des

kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces

des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires

coloreacutees

recommandeacutee pour la conservation de

mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre

laboratoire pour avis

indispensable pour le diagnostic de certains

parasites (Cryptosporides microsporides)

Meacutethodes de coloration rapides

(Colorations en tubes)

- Meacutethode de Bailenger et Faraggi

- Meacutethode de Sapro Lawless et

Strome

-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene

tamporeacute

-Meacutethode de Horkin

- Meacutethode de Sargeaut

-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero

Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de

Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-

formol Apregraves meacutelange

- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave

laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout

-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le

fond du tube

-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en

protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees

immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine

des noyaux est coloreacutee en brun par liode

Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent

donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol

sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement

leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes

- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou

directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension

de selles avec le colorant

Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des

protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux

apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs

jours

la coloration de Bailenger

Laisser pendant une nuit en contact

cristal violet 2 g

fuchsine basique 005 g

alcool agrave 95deg 20 ml

pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml

eau distilleacutee 100 ml

Coloration des frottis

Pour bien observer les structures nucleacuteaires et

garder des lames de reacutefeacuterence on

confectionne un frottis de selles humide et

eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en

- 3 temps fixation puis coloration puis

diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)

- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg

Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)

Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag

- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher

soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains

dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)

soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)

soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1

heure)

-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode

-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau

- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3

30 min agrave leacutetuve agrave 37deg

- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece

24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs

-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au

microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent

nettement

-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau

-Deacuteshydrater

-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est

poseacutee deacutefinitivement

- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les

trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure

des noyaux Les kystes apparaissent en bleu

pacircle avec des noyaux bien nets Cest une

technique facile agrave reacutealiser

- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible

- Plonger la lame dans le fixateur colorant de

Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures

- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au

baume de Canada ou au baume syntheacutetique

Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par

Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie

- Seacutechage

- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol

- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid

- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet

- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20

secondes en agitant

- Rinccedilage

-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5

- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100

- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert

Coloration des microscporidies

Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10

- Effectuer un frottis de la selle

- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de

meacutethanol

- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes

- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord

en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml

- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge

Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee

microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-

Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution

- Colorer pendant 3 heures

- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02

-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-

Rincer seacutecher et lire au grossissement x100

Coloration par Uvitex 2B

Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute

pour la chitine Met en eacutevidence les

microsporidie par une fluorescence

directe On obtient une

fluorescence bleue pale sur fond

noir

Scotch test anal ( test de Graham agrave

la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius

vermicularis ainsi que les anneaux ou les

oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors

de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est

appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant

toute toilette en position foetale ou genou

pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus

et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute

sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera

agrave lrsquoobjectif X10

NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les

parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que

la technique devra ecirctre faite avec des gants

ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite

pour eacuteviter la contamination par les oeufs

auto-infestant de lrsquooxyure

Meacutethodes speacuteciales

Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon

eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs

drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle

de la taille drsquoun petit pois

Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen

des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm

dans une quantiteacute de vert malachite agrave

3 (contre colorant) et de glyceacuterine

appliquer la bande sur la selle et sur la

lame renverser et appuyer sur la

paillasse

Methode de Kato-Katz quantitative

utilise un gabarie pour la selle

Meacutethode efficace pour la recherche

doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale

mais inutilisable pour les kytes et les

larves ainsi que les oeufs dankylostome

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

Techniques de conservation

Conservation provisoire par le froid (+4degC)

-Bonne conservation des kystes de protozoaires etou

œufs drsquohelminthes

-Mort rapide des trophozoites de protozoaire

-Mort les larves drsquoanguilules

Meacutethode agrave lrsquoeau formoleacutee ( fixation conservation)

-Aldehyde formique( formol) de 5 agrave 20

-Glyceacuterine( facultatif)

-Eau distilleacutee ou lrsquoeau physiologique 100ml La selle +

3 vol 1 vol

tamiser Sedimenter stoker

Bonne conservation œufs drsquohelminthe et kystes de

protozoaires tant que le preacutelegravevement reste liquide

Fixation au MIF (Merthiolate-Iode-Formol)

SOLUTION 1 de mercurothiolate iode

ndashformol

-teinture de mercurethiolate 200 ml

-glycerine 5 ml

-formol agrave 40 25 ml

-eau distilleacutee 250 ml

SOLUTION 2 de Lugol

-iode 05 g

-iode de potassium 1g

-eau distilleacutee 10 ml

1175 ml 075ml +

3 agrave 5 g selles

Triturer stoker

Conservation beaucoups plus longue des

formes veacutegeacutetatives et les kystes de protozoaires

Meacutelange fixateur agrave lrsquoalcool polyvinylique APV

APV

-alcool polyvinylique en poudre

5g

-glyceacuterol 15ml

-eau distilleacutee 625 ml

un bain marie ( 70 -75degC)10mn

Fixateur de Schaudinn modifieacute

-cristaux de clorure de mercure HgCl2

15g

-ethanol agrave 95 31 ml

Acide aceacutetique glacial 5ml +

2 agrave 3 mn

-Bonne conservation

-Une fixtion permettant de pratiquer des

frottis pouvant etre coloreacutes

Concervation des vers

Neacutematotes

Treacutematodes

cestodes

+ eau physiologique Entre 2 lames

Plongeacutes dan un fixteur

Ex - alcool 70 bouillant

- meacutelange alcool et formol

Aspect normal de la selle - poids de 110 agrave 150 g

- couleur brune

- Une consistance ferme et un aspect mouleacute

-- Un pH drsquoenviron 7

Microscopiquement en doit observeacute

-- Des fibres musculaires

-- De la cellulose non digestible poils vaisseaux

ligneux eacuteleacutements scleacutereux

-- de lrsquoamidon si le reacutegime est riche en feacuteculents et chez

lrsquoenfant

-- Quelques masses amorphes ou disques radieacutes ( les

savons)

-- il ne doit pas avoir de globules gras ( graisses

neutres)

COPROLOGIE PARASITAIRE Conduite de lrsquoexamen

1048766 Examen macroscopique

1048766 Examen microscopique

- Examen direct sans concentration

- Examen direct apreacutes concentration

- Les meacutethodes physiques

- Techniques de flottation

- Techniques de seacutedimentation

- Les meacutethodes physico-chimiques

- Les meacutethodes combineacutees

-Colorations speacutecifiques

- cultures

- Examens particuliers

Lrsquoobservation macroscopique Il permet de noter

- Couleur ( brune jaune ou ocre verte

deacutecoloreacutee noire rouge)

- consistance (molle dure liquide)

- aspect (preacutesence de bulles ou de gras

steacuteatorrheacutee)

- Preacutesence drsquoeacuteleacutements surajouteacutes

-Parasites adulte drsquoAscaris femelle drsquooxuyre

anneau ou chaine de taenia

-glaire (mucus)

-sang de pus

Lrsquoexamen direct sans concentration -Lexamen direct est le seule examen qui permet drsquoappreacutecier la vitaliteacute des

parasites

-Il met en eacutevidence les kystes et les formes veacutegeacutetatives de protozoaires ainsi

quelques oeufs et les larves dhelminthes

- On peut rajouter du Lugol double sur la lame qui fixe et colore les

structure nucleacuteaires

- Quelque soit le reacutesultat de lrsquoexamen direct on doit obligatoirement le

compleacuteter par deux techniques de concentration lrsquoune pour les kystes et

lrsquoautre pour les oeufs

- Il est impeacuteratif de connaitre la deacutescription des eacuteleacutements parasitaire et

de retenir les possibles faux parasites

Lrsquoobservation microscopique

une noisette de selle

(agrave diffeacuterents endroits)

lrsquoeau physiologique

agrave 09

suspension homogegravene

2 gouttes sur une

lame recouvrir par

une lamelle

lecture en

zig-zag x10

x 40

+

Les meacutethodes de concentrations

Les techniques par lesquelles on

essaie agrave partir de la grande quantiteacute

de la matieres feacutecales recueillies

drsquoobtenir dans un faible volume les

œufs larves kystes voire formes

veacutegeacutetatifs fixeacutees de parasites par

eacutelimination des reacutesidus de la

digestion

Les meacutethodes physiques

Les selles dilueacutees dans un reacuteactif de densiteacute

diffeacuterente de celle de parasite

DR superieur DP = flottation

DR inferieur DP = seacutedimentation

A-Techniques de flottation

Crsquoest une technique part du principe que la densiteacute du liquide et supeacuterieur

agrave celle des parasites ces derniers plus leacutegers flottent agrave la surface

Les principales techniques de flottation

- Meacutethode de Fullborn (1920) elle utilise une solution satureacutee de NaCl

(NaCl 250g ED 750ml d=12)

- Meacutethode de Willis (1921) simple et utilisable en routine

bullDiluer une noisette de selle dans la solution satureacutee de NaCl agrave 25

bullRemplissez un tube en verre conique jusquagrave sonbord en formant un

meacutenisque concave (verre de montre) sur lequel on deacutepose une lamelle

pendant 15 minutes (pas plus pour eacuteviter la cristalisation des oeufs) On la

deacutepose ensuite sur une lame porte objet et on observe agrave lrsquoobjectif X10 agrave la

recherche des OEufs drsquohelminthes tels que ceux drsquoHymenolepis ou

drsquoAnkylstomes

-Meacutethode de Janeckso et Urbanyi(1931) utilise comme reacuteactif une

solution de domercurate de potassium ( d=114) qui doit etre manipuleacutee

avec prudence

Iodo-mercurate de potassium

Bi iodure de mercure 100g

Iodure de potassium 74g

Eau distilleacutee 50 ml

-Meacutethode de Faust (1938) on centrifuge agrave 1500 tm une dilution des

selles dans lrsquoeau ordinaire tieacutede et on rejette le surnageant et on remet le

culot en suspension dans drsquoeau On reacutepegravete lrsquoopeacuteration jusqursquoagrave ce que le

surnageant soit limpide on remet alors le culot en suspension dans le

sulfate de Zink agrave 33 Apreacutes centrifugation on preacutelegraveve agrave lrsquoanse de

platine la pellicule de surfase qursquoon examine au microscope

- Meacutethode drsquoOtto Hwitt et Straham (1941) on procegravede de la meme

maniere que pour le Willis mais avec une solution aqueuse de sulfate

de Zink agrave 33 D=118

Avantage -Technique simple

-Mateacuteriel rudimentaire

- reacutealisation en seacuterie

-Sensibiliteacute treacutes bonne++++

Inconveacutenient

-Elle a ce pendant lrsquoinconveacutenient drsquoalteacuterer des Larves et les

Kystes pour les quels elle est contre-indiqueacutee ( reactifs

hypertoniques) de mecircme que pour les selles liquides ou

riches en lipides

-Elle donne de bons reacutesultats pour les oeufs drsquohelminthes

leacutegers (oeufs drsquoHymenolepis drsquoAnkylostome et deTaelignia)

B-Techniques de seacutedimentation bullLe diluant a une densiteacute inferieure agrave celle du

parasite alors se dernier se seacutedimente

Les principales techniques

- Meacutethode par seacutedimentation simple

- Meacutethode de Faust et IngallsReacutealiseacutee en utilisant

lrsquoeau glyceacuterineacutee (Eau + Glyceacuterine agrave 05) elle

permet drsquoaugmenter la mouillabiliteacute qui facilite la

seacutedimentation des parasites larves Anguillules

Œufs drsquoAscaris non feacutecondeacutes et œufs de

Schistosoma mansoni

-Meacutethode de Baroody et MostSeacutedimentation

centrifugation Eau de robinet chauffeacutee agrave 42degC

- Meacutethode de Jahnes et Hodges

Avantage -Technique simple

-Mateacuteriel rudimentaire

- reacutealisation en seacuterie

- Traitent une grande masse feacutecale ( parasites rares ou irreacuteguliegraverere ment

repartis dans la selle)

Inconveacutenient -une technique longue agrave reacutealiser

-Les cellules veacutegeacutetales seacutedimentent aussi vite que les parasites (Preacutesence

de certains reacutesidus)

-Non indiqueacutes en routine (sensibiliteacute

moyenne++)

Meacutethodes physico-chimiques ou

Diphasiques Caracteacuteriseacutees par la mise en preacutesence de deux

phases non miscibles lrsquoune aqueuse et lrsquoautre

constitueacutee par lrsquoeacutether qui est un solvant des lipidesil

se creacutee un coefficient de partage entre ces deux

phases et la reacutepartition de chaque eacuteleacutement feacutecal dans

chacune drsquoelles sera isoleacutes en fonction de son pouvoir

hydrophile ou lipophile

Bailenger a montreacute que le pH de la solution eacutetait

leacuteleacutement deacuteterminant pour la plus ou moins grande

efficaciteacute dune technique selon le parasite rechercheacute

Principes theacuteoriques

-Les selles tritureacutees (meacutelange au dixiegraveme environ) dans la solution choisie - elle peut ecirctre preacutealablement passeacutee sur un tamis pour eacuteliminer les gros deacutebris

le filtrat est verseacute dans un tube agrave centrifuger agrave fond conique en le remplissant 13

deacutether de maniegravere agrave ce quil y ai 23 du meacutelange selle en laissant 1 cm pour

fermer le tube

- Lrsquoagiter pendant une minute

- La suspension eacutetheacutero-liquide obtenue est centrifugeacutee agrave une vitesse lente de

lordre de 1500 agrave 2000 toursminute pendant une agrave trois minutes

- Apregraves centrifugation les constituants de la suspension sont reacutepartis en quatre

Couches

- Deacutecoller la couche des reacutesidus lipophiles agrave laide dune baguette de verre

- Retourner le tube au dessus de leacutevier (en faisant couler de leau) ou dun bac agrave

deacutechets liquides

- Essuyer les parois du tube avec un coton tenu agrave la pince en laissant toujours le

tube avec louverture dirigeacutee vers le bas pour eacuteviter de souiller le culot avec les

reacutesidus

- Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique pour

remettre en suspension le culot qui sera examineacute

- le culot qui nous inteacuteresse qui contient les eacuteleacutement parasitaires (kystes des

protozoaires)

Ether Debris

Phase aqueuse

Le culot

Les meacutethodes diphasiques sont

-Meacutethode de Telmann 1908

-Meacutethode De Rivas 1928

-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917

-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946

-Meacutethode De Ritchie 1948

-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood

-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf

-Meacutethode De Roman 1957

-Meacutethode de Bailenger 1962-1963

-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle

-Meacutethode de Junod 1927

Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage

Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia

Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)

La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble

lors de la centrifugation ce qui est un argument

diagnostique inteacuteressant

- Inconveacutenients

Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve

restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave

deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses

- Deacuteroulement de la technique

acide aceacutetique cristallisable 5 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethode de Bailenger - Avantages

Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et

des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5

(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)

- Inconveacutenients

Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre

technique est neacutecessaire

- Deacuteroulement de la technique

aceacutetate de sodium 15 g

acide aceacutetique 36 ml

eau distilleacutee qsp 1000 ml

Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide

dun pH-megravetre

Meacutethode de Ritchie simplifieacutee

- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles

formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour

enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les

oeufs dascaris et de schistosome

- Inconveacutenients

Le culot souvent volumineux est de lecture difficile

- Deacuteroulement de la technique

- Solutions de Ritchie

eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt

eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)

Meacutethode de Blagg et al

-Avantages

-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire

les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de

liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de

mercure souille les effluents du laboratoire

- Deacuteroulement de la technique

Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou

additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est

verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation

eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes

Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)

permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute

Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et

recommencer lagitation

On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et

cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee

Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages

-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles

Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes

aiseacutement et facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de

schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue

que les techniques en un temps

- Deacuteroulement de la technique

A) NaCl 9 g

formol officinal 10 ml

eau qsp 1000 ml

B) acide citrique 100 g

formol officinal 20 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethodes combineacutees

Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et

par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande

quantiteacute de selles

Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les

rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des

formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale

- Inconveacutenients

Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez

mal - Deacuteroulement de la technique

A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml

formol officinal 100 ml

eau qsp 1 000 ml

B bromure de sodium cristalliseacute 622 g

eau distilleacutee 1000 ml

Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant

pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou

kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour

trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente

- Inconveacutenients

Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps

assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate

preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)

- Deacuteroulement de la technique

- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)

liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml

eau distilleacutee 334 ml

Concentration diphasique

(MIF ou Bailenger)

une solution de

sulfate de zinc

30 secondes agrave f v

dilueacute au quart avec ED

Examiner

Le culot

Examiner

Le culot

iodomercurate

de potassium

de densiteacute 15

dilueacute au quart avec ED

Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod

simplifieacutee) - Avantages

donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete

- Inconveacutenients

Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi

dune solution de iodomercurate

- Deacuteroulement de la technique

Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)

- aceacutetate de sodium 15 g

- acide aceacutetique cristallisable 20 ml

- formol 40 ml

-eau qsp 1000 ml

Solution B (densiteacute 140)

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 442 volumes

8 g de selles

50 ml de solution de NaCl agrave

85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min

Suspension homo

+Tamisage Examiner

Le culot

eacuteliminer

le surnageant

20 ml dune solution A

+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique

1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min

4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer

le surnageant

Examiner

Le culot

Meacutethode de seacutedimentation-flottation

pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves

- Inconveacutenients

Quand la teneur des selles en lipides est anormalement

eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de

graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique

Solution de densiteacute 135

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 520 volumes

la suspension feacutecale en

eau agrave 85 de NaCl

1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min

1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min

20 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacute

eacuteliminer

le surnageant

5 agrave 7 ml de solution diodomercurate

de potassium de densiteacute 135 20 ml deau

Examen du culot

Seacutedimentation-flottation au saccharose

pour protozoaires - Avantages

permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les

kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand

lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste

na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des

selles fixeacutees au MIF

- Inconveacutenients

Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et

flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De

plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre

que des sels de mercure sont encore utiliseacutes

-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose

saccharose 120 g

eau 200 ml

Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et

utiliser alors

saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml

Suspension homo

+Tamisage +

2 agrave 3 heures

50 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacutee

fraicircche

10 agrave 15 ml de la suspension

1800-2000 toursmin 90sec

rejeter le surnageant

L 1 en12humide

3 agrave 4 g de selles

Seacute

dim

en

tatio

n

8 agrave 10 ml de solution de saccharose

+ 05 ml de solution de chlorure

mercurique agrave 15 en ED

1000 toursmin 45 sec

deacutecanter le

surnageant

dans T2

L 2 en12humide

Flottation

T2 20 agrave 30 ml deau

2000 toursmin90 sec

L 3 en12humide

Preacutecipitation

Les colorations

utile en cas de doute lrsquoidentification des

kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces

des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires

coloreacutees

recommandeacutee pour la conservation de

mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre

laboratoire pour avis

indispensable pour le diagnostic de certains

parasites (Cryptosporides microsporides)

Meacutethodes de coloration rapides

(Colorations en tubes)

- Meacutethode de Bailenger et Faraggi

- Meacutethode de Sapro Lawless et

Strome

-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene

tamporeacute

-Meacutethode de Horkin

- Meacutethode de Sargeaut

-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero

Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de

Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-

formol Apregraves meacutelange

- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave

laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout

-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le

fond du tube

-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en

protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees

immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine

des noyaux est coloreacutee en brun par liode

Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent

donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol

sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement

leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes

- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou

directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension

de selles avec le colorant

Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des

protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux

apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs

jours

la coloration de Bailenger

Laisser pendant une nuit en contact

cristal violet 2 g

fuchsine basique 005 g

alcool agrave 95deg 20 ml

pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml

eau distilleacutee 100 ml

Coloration des frottis

Pour bien observer les structures nucleacuteaires et

garder des lames de reacutefeacuterence on

confectionne un frottis de selles humide et

eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en

- 3 temps fixation puis coloration puis

diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)

- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg

Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)

Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag

- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher

soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains

dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)

soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)

soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1

heure)

-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode

-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau

- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3

30 min agrave leacutetuve agrave 37deg

- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece

24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs

-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au

microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent

nettement

-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau

-Deacuteshydrater

-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est

poseacutee deacutefinitivement

- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les

trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure

des noyaux Les kystes apparaissent en bleu

pacircle avec des noyaux bien nets Cest une

technique facile agrave reacutealiser

- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible

- Plonger la lame dans le fixateur colorant de

Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures

- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au

baume de Canada ou au baume syntheacutetique

Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par

Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie

- Seacutechage

- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol

- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid

- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet

- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20

secondes en agitant

- Rinccedilage

-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5

- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100

- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert

Coloration des microscporidies

Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10

- Effectuer un frottis de la selle

- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de

meacutethanol

- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes

- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord

en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml

- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge

Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee

microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-

Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution

- Colorer pendant 3 heures

- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02

-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-

Rincer seacutecher et lire au grossissement x100

Coloration par Uvitex 2B

Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute

pour la chitine Met en eacutevidence les

microsporidie par une fluorescence

directe On obtient une

fluorescence bleue pale sur fond

noir

Scotch test anal ( test de Graham agrave

la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius

vermicularis ainsi que les anneaux ou les

oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors

de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est

appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant

toute toilette en position foetale ou genou

pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus

et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute

sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera

agrave lrsquoobjectif X10

NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les

parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que

la technique devra ecirctre faite avec des gants

ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite

pour eacuteviter la contamination par les oeufs

auto-infestant de lrsquooxyure

Meacutethodes speacuteciales

Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon

eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs

drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle

de la taille drsquoun petit pois

Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen

des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm

dans une quantiteacute de vert malachite agrave

3 (contre colorant) et de glyceacuterine

appliquer la bande sur la selle et sur la

lame renverser et appuyer sur la

paillasse

Methode de Kato-Katz quantitative

utilise un gabarie pour la selle

Meacutethode efficace pour la recherche

doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale

mais inutilisable pour les kytes et les

larves ainsi que les oeufs dankylostome

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

Meacutethode agrave lrsquoeau formoleacutee ( fixation conservation)

-Aldehyde formique( formol) de 5 agrave 20

-Glyceacuterine( facultatif)

-Eau distilleacutee ou lrsquoeau physiologique 100ml La selle +

3 vol 1 vol

tamiser Sedimenter stoker

Bonne conservation œufs drsquohelminthe et kystes de

protozoaires tant que le preacutelegravevement reste liquide

Fixation au MIF (Merthiolate-Iode-Formol)

SOLUTION 1 de mercurothiolate iode

ndashformol

-teinture de mercurethiolate 200 ml

-glycerine 5 ml

-formol agrave 40 25 ml

-eau distilleacutee 250 ml

SOLUTION 2 de Lugol

-iode 05 g

-iode de potassium 1g

-eau distilleacutee 10 ml

1175 ml 075ml +

3 agrave 5 g selles

Triturer stoker

Conservation beaucoups plus longue des

formes veacutegeacutetatives et les kystes de protozoaires

Meacutelange fixateur agrave lrsquoalcool polyvinylique APV

APV

-alcool polyvinylique en poudre

5g

-glyceacuterol 15ml

-eau distilleacutee 625 ml

un bain marie ( 70 -75degC)10mn

Fixateur de Schaudinn modifieacute

-cristaux de clorure de mercure HgCl2

15g

-ethanol agrave 95 31 ml

Acide aceacutetique glacial 5ml +

2 agrave 3 mn

-Bonne conservation

-Une fixtion permettant de pratiquer des

frottis pouvant etre coloreacutes

Concervation des vers

Neacutematotes

Treacutematodes

cestodes

+ eau physiologique Entre 2 lames

Plongeacutes dan un fixteur

Ex - alcool 70 bouillant

- meacutelange alcool et formol

Aspect normal de la selle - poids de 110 agrave 150 g

- couleur brune

- Une consistance ferme et un aspect mouleacute

-- Un pH drsquoenviron 7

Microscopiquement en doit observeacute

-- Des fibres musculaires

-- De la cellulose non digestible poils vaisseaux

ligneux eacuteleacutements scleacutereux

-- de lrsquoamidon si le reacutegime est riche en feacuteculents et chez

lrsquoenfant

-- Quelques masses amorphes ou disques radieacutes ( les

savons)

-- il ne doit pas avoir de globules gras ( graisses

neutres)

COPROLOGIE PARASITAIRE Conduite de lrsquoexamen

1048766 Examen macroscopique

1048766 Examen microscopique

- Examen direct sans concentration

- Examen direct apreacutes concentration

- Les meacutethodes physiques

- Techniques de flottation

- Techniques de seacutedimentation

- Les meacutethodes physico-chimiques

- Les meacutethodes combineacutees

-Colorations speacutecifiques

- cultures

- Examens particuliers

Lrsquoobservation macroscopique Il permet de noter

- Couleur ( brune jaune ou ocre verte

deacutecoloreacutee noire rouge)

- consistance (molle dure liquide)

- aspect (preacutesence de bulles ou de gras

steacuteatorrheacutee)

- Preacutesence drsquoeacuteleacutements surajouteacutes

-Parasites adulte drsquoAscaris femelle drsquooxuyre

anneau ou chaine de taenia

-glaire (mucus)

-sang de pus

Lrsquoexamen direct sans concentration -Lexamen direct est le seule examen qui permet drsquoappreacutecier la vitaliteacute des

parasites

-Il met en eacutevidence les kystes et les formes veacutegeacutetatives de protozoaires ainsi

quelques oeufs et les larves dhelminthes

- On peut rajouter du Lugol double sur la lame qui fixe et colore les

structure nucleacuteaires

- Quelque soit le reacutesultat de lrsquoexamen direct on doit obligatoirement le

compleacuteter par deux techniques de concentration lrsquoune pour les kystes et

lrsquoautre pour les oeufs

- Il est impeacuteratif de connaitre la deacutescription des eacuteleacutements parasitaire et

de retenir les possibles faux parasites

Lrsquoobservation microscopique

une noisette de selle

(agrave diffeacuterents endroits)

lrsquoeau physiologique

agrave 09

suspension homogegravene

2 gouttes sur une

lame recouvrir par

une lamelle

lecture en

zig-zag x10

x 40

+

Les meacutethodes de concentrations

Les techniques par lesquelles on

essaie agrave partir de la grande quantiteacute

de la matieres feacutecales recueillies

drsquoobtenir dans un faible volume les

œufs larves kystes voire formes

veacutegeacutetatifs fixeacutees de parasites par

eacutelimination des reacutesidus de la

digestion

Les meacutethodes physiques

Les selles dilueacutees dans un reacuteactif de densiteacute

diffeacuterente de celle de parasite

DR superieur DP = flottation

DR inferieur DP = seacutedimentation

A-Techniques de flottation

Crsquoest une technique part du principe que la densiteacute du liquide et supeacuterieur

agrave celle des parasites ces derniers plus leacutegers flottent agrave la surface

Les principales techniques de flottation

- Meacutethode de Fullborn (1920) elle utilise une solution satureacutee de NaCl

(NaCl 250g ED 750ml d=12)

- Meacutethode de Willis (1921) simple et utilisable en routine

bullDiluer une noisette de selle dans la solution satureacutee de NaCl agrave 25

bullRemplissez un tube en verre conique jusquagrave sonbord en formant un

meacutenisque concave (verre de montre) sur lequel on deacutepose une lamelle

pendant 15 minutes (pas plus pour eacuteviter la cristalisation des oeufs) On la

deacutepose ensuite sur une lame porte objet et on observe agrave lrsquoobjectif X10 agrave la

recherche des OEufs drsquohelminthes tels que ceux drsquoHymenolepis ou

drsquoAnkylstomes

-Meacutethode de Janeckso et Urbanyi(1931) utilise comme reacuteactif une

solution de domercurate de potassium ( d=114) qui doit etre manipuleacutee

avec prudence

Iodo-mercurate de potassium

Bi iodure de mercure 100g

Iodure de potassium 74g

Eau distilleacutee 50 ml

-Meacutethode de Faust (1938) on centrifuge agrave 1500 tm une dilution des

selles dans lrsquoeau ordinaire tieacutede et on rejette le surnageant et on remet le

culot en suspension dans drsquoeau On reacutepegravete lrsquoopeacuteration jusqursquoagrave ce que le

surnageant soit limpide on remet alors le culot en suspension dans le

sulfate de Zink agrave 33 Apreacutes centrifugation on preacutelegraveve agrave lrsquoanse de

platine la pellicule de surfase qursquoon examine au microscope

- Meacutethode drsquoOtto Hwitt et Straham (1941) on procegravede de la meme

maniere que pour le Willis mais avec une solution aqueuse de sulfate

de Zink agrave 33 D=118

Avantage -Technique simple

-Mateacuteriel rudimentaire

- reacutealisation en seacuterie

-Sensibiliteacute treacutes bonne++++

Inconveacutenient

-Elle a ce pendant lrsquoinconveacutenient drsquoalteacuterer des Larves et les

Kystes pour les quels elle est contre-indiqueacutee ( reactifs

hypertoniques) de mecircme que pour les selles liquides ou

riches en lipides

-Elle donne de bons reacutesultats pour les oeufs drsquohelminthes

leacutegers (oeufs drsquoHymenolepis drsquoAnkylostome et deTaelignia)

B-Techniques de seacutedimentation bullLe diluant a une densiteacute inferieure agrave celle du

parasite alors se dernier se seacutedimente

Les principales techniques

- Meacutethode par seacutedimentation simple

- Meacutethode de Faust et IngallsReacutealiseacutee en utilisant

lrsquoeau glyceacuterineacutee (Eau + Glyceacuterine agrave 05) elle

permet drsquoaugmenter la mouillabiliteacute qui facilite la

seacutedimentation des parasites larves Anguillules

Œufs drsquoAscaris non feacutecondeacutes et œufs de

Schistosoma mansoni

-Meacutethode de Baroody et MostSeacutedimentation

centrifugation Eau de robinet chauffeacutee agrave 42degC

- Meacutethode de Jahnes et Hodges

Avantage -Technique simple

-Mateacuteriel rudimentaire

- reacutealisation en seacuterie

- Traitent une grande masse feacutecale ( parasites rares ou irreacuteguliegraverere ment

repartis dans la selle)

Inconveacutenient -une technique longue agrave reacutealiser

-Les cellules veacutegeacutetales seacutedimentent aussi vite que les parasites (Preacutesence

de certains reacutesidus)

-Non indiqueacutes en routine (sensibiliteacute

moyenne++)

Meacutethodes physico-chimiques ou

Diphasiques Caracteacuteriseacutees par la mise en preacutesence de deux

phases non miscibles lrsquoune aqueuse et lrsquoautre

constitueacutee par lrsquoeacutether qui est un solvant des lipidesil

se creacutee un coefficient de partage entre ces deux

phases et la reacutepartition de chaque eacuteleacutement feacutecal dans

chacune drsquoelles sera isoleacutes en fonction de son pouvoir

hydrophile ou lipophile

Bailenger a montreacute que le pH de la solution eacutetait

leacuteleacutement deacuteterminant pour la plus ou moins grande

efficaciteacute dune technique selon le parasite rechercheacute

Principes theacuteoriques

-Les selles tritureacutees (meacutelange au dixiegraveme environ) dans la solution choisie - elle peut ecirctre preacutealablement passeacutee sur un tamis pour eacuteliminer les gros deacutebris

le filtrat est verseacute dans un tube agrave centrifuger agrave fond conique en le remplissant 13

deacutether de maniegravere agrave ce quil y ai 23 du meacutelange selle en laissant 1 cm pour

fermer le tube

- Lrsquoagiter pendant une minute

- La suspension eacutetheacutero-liquide obtenue est centrifugeacutee agrave une vitesse lente de

lordre de 1500 agrave 2000 toursminute pendant une agrave trois minutes

- Apregraves centrifugation les constituants de la suspension sont reacutepartis en quatre

Couches

- Deacutecoller la couche des reacutesidus lipophiles agrave laide dune baguette de verre

- Retourner le tube au dessus de leacutevier (en faisant couler de leau) ou dun bac agrave

deacutechets liquides

- Essuyer les parois du tube avec un coton tenu agrave la pince en laissant toujours le

tube avec louverture dirigeacutee vers le bas pour eacuteviter de souiller le culot avec les

reacutesidus

- Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique pour

remettre en suspension le culot qui sera examineacute

- le culot qui nous inteacuteresse qui contient les eacuteleacutement parasitaires (kystes des

protozoaires)

Ether Debris

Phase aqueuse

Le culot

Les meacutethodes diphasiques sont

-Meacutethode de Telmann 1908

-Meacutethode De Rivas 1928

-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917

-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946

-Meacutethode De Ritchie 1948

-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood

-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf

-Meacutethode De Roman 1957

-Meacutethode de Bailenger 1962-1963

-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle

-Meacutethode de Junod 1927

Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage

Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia

Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)

La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble

lors de la centrifugation ce qui est un argument

diagnostique inteacuteressant

- Inconveacutenients

Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve

restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave

deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses

- Deacuteroulement de la technique

acide aceacutetique cristallisable 5 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethode de Bailenger - Avantages

Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et

des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5

(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)

- Inconveacutenients

Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre

technique est neacutecessaire

- Deacuteroulement de la technique

aceacutetate de sodium 15 g

acide aceacutetique 36 ml

eau distilleacutee qsp 1000 ml

Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide

dun pH-megravetre

Meacutethode de Ritchie simplifieacutee

- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles

formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour

enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les

oeufs dascaris et de schistosome

- Inconveacutenients

Le culot souvent volumineux est de lecture difficile

- Deacuteroulement de la technique

- Solutions de Ritchie

eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt

eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)

Meacutethode de Blagg et al

-Avantages

-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire

les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de

liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de

mercure souille les effluents du laboratoire

- Deacuteroulement de la technique

Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou

additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est

verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation

eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes

Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)

permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute

Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et

recommencer lagitation

On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et

cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee

Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages

-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles

Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes

aiseacutement et facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de

schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue

que les techniques en un temps

- Deacuteroulement de la technique

A) NaCl 9 g

formol officinal 10 ml

eau qsp 1000 ml

B) acide citrique 100 g

formol officinal 20 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethodes combineacutees

Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et

par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande

quantiteacute de selles

Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les

rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des

formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale

- Inconveacutenients

Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez

mal - Deacuteroulement de la technique

A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml

formol officinal 100 ml

eau qsp 1 000 ml

B bromure de sodium cristalliseacute 622 g

eau distilleacutee 1000 ml

Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant

pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou

kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour

trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente

- Inconveacutenients

Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps

assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate

preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)

- Deacuteroulement de la technique

- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)

liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml

eau distilleacutee 334 ml

Concentration diphasique

(MIF ou Bailenger)

une solution de

sulfate de zinc

30 secondes agrave f v

dilueacute au quart avec ED

Examiner

Le culot

Examiner

Le culot

iodomercurate

de potassium

de densiteacute 15

dilueacute au quart avec ED

Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod

simplifieacutee) - Avantages

donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete

- Inconveacutenients

Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi

dune solution de iodomercurate

- Deacuteroulement de la technique

Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)

- aceacutetate de sodium 15 g

- acide aceacutetique cristallisable 20 ml

- formol 40 ml

-eau qsp 1000 ml

Solution B (densiteacute 140)

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 442 volumes

8 g de selles

50 ml de solution de NaCl agrave

85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min

Suspension homo

+Tamisage Examiner

Le culot

eacuteliminer

le surnageant

20 ml dune solution A

+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique

1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min

4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer

le surnageant

Examiner

Le culot

Meacutethode de seacutedimentation-flottation

pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves

- Inconveacutenients

Quand la teneur des selles en lipides est anormalement

eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de

graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique

Solution de densiteacute 135

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 520 volumes

la suspension feacutecale en

eau agrave 85 de NaCl

1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min

1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min

20 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacute

eacuteliminer

le surnageant

5 agrave 7 ml de solution diodomercurate

de potassium de densiteacute 135 20 ml deau

Examen du culot

Seacutedimentation-flottation au saccharose

pour protozoaires - Avantages

permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les

kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand

lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste

na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des

selles fixeacutees au MIF

- Inconveacutenients

Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et

flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De

plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre

que des sels de mercure sont encore utiliseacutes

-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose

saccharose 120 g

eau 200 ml

Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et

utiliser alors

saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml

Suspension homo

+Tamisage +

2 agrave 3 heures

50 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacutee

fraicircche

10 agrave 15 ml de la suspension

1800-2000 toursmin 90sec

rejeter le surnageant

L 1 en12humide

3 agrave 4 g de selles

Seacute

dim

en

tatio

n

8 agrave 10 ml de solution de saccharose

+ 05 ml de solution de chlorure

mercurique agrave 15 en ED

1000 toursmin 45 sec

deacutecanter le

surnageant

dans T2

L 2 en12humide

Flottation

T2 20 agrave 30 ml deau

2000 toursmin90 sec

L 3 en12humide

Preacutecipitation

Les colorations

utile en cas de doute lrsquoidentification des

kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces

des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires

coloreacutees

recommandeacutee pour la conservation de

mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre

laboratoire pour avis

indispensable pour le diagnostic de certains

parasites (Cryptosporides microsporides)

Meacutethodes de coloration rapides

(Colorations en tubes)

- Meacutethode de Bailenger et Faraggi

- Meacutethode de Sapro Lawless et

Strome

-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene

tamporeacute

-Meacutethode de Horkin

- Meacutethode de Sargeaut

-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero

Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de

Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-

formol Apregraves meacutelange

- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave

laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout

-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le

fond du tube

-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en

protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees

immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine

des noyaux est coloreacutee en brun par liode

Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent

donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol

sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement

leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes

- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou

directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension

de selles avec le colorant

Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des

protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux

apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs

jours

la coloration de Bailenger

Laisser pendant une nuit en contact

cristal violet 2 g

fuchsine basique 005 g

alcool agrave 95deg 20 ml

pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml

eau distilleacutee 100 ml

Coloration des frottis

Pour bien observer les structures nucleacuteaires et

garder des lames de reacutefeacuterence on

confectionne un frottis de selles humide et

eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en

- 3 temps fixation puis coloration puis

diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)

- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg

Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)

Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag

- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher

soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains

dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)

soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)

soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1

heure)

-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode

-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau

- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3

30 min agrave leacutetuve agrave 37deg

- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece

24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs

-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au

microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent

nettement

-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau

-Deacuteshydrater

-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est

poseacutee deacutefinitivement

- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les

trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure

des noyaux Les kystes apparaissent en bleu

pacircle avec des noyaux bien nets Cest une

technique facile agrave reacutealiser

- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible

- Plonger la lame dans le fixateur colorant de

Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures

- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au

baume de Canada ou au baume syntheacutetique

Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par

Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie

- Seacutechage

- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol

- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid

- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet

- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20

secondes en agitant

- Rinccedilage

-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5

- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100

- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert

Coloration des microscporidies

Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10

- Effectuer un frottis de la selle

- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de

meacutethanol

- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes

- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord

en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml

- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge

Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee

microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-

Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution

- Colorer pendant 3 heures

- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02

-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-

Rincer seacutecher et lire au grossissement x100

Coloration par Uvitex 2B

Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute

pour la chitine Met en eacutevidence les

microsporidie par une fluorescence

directe On obtient une

fluorescence bleue pale sur fond

noir

Scotch test anal ( test de Graham agrave

la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius

vermicularis ainsi que les anneaux ou les

oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors

de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est

appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant

toute toilette en position foetale ou genou

pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus

et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute

sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera

agrave lrsquoobjectif X10

NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les

parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que

la technique devra ecirctre faite avec des gants

ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite

pour eacuteviter la contamination par les oeufs

auto-infestant de lrsquooxyure

Meacutethodes speacuteciales

Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon

eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs

drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle

de la taille drsquoun petit pois

Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen

des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm

dans une quantiteacute de vert malachite agrave

3 (contre colorant) et de glyceacuterine

appliquer la bande sur la selle et sur la

lame renverser et appuyer sur la

paillasse

Methode de Kato-Katz quantitative

utilise un gabarie pour la selle

Meacutethode efficace pour la recherche

doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale

mais inutilisable pour les kytes et les

larves ainsi que les oeufs dankylostome

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

Fixation au MIF (Merthiolate-Iode-Formol)

SOLUTION 1 de mercurothiolate iode

ndashformol

-teinture de mercurethiolate 200 ml

-glycerine 5 ml

-formol agrave 40 25 ml

-eau distilleacutee 250 ml

SOLUTION 2 de Lugol

-iode 05 g

-iode de potassium 1g

-eau distilleacutee 10 ml

1175 ml 075ml +

3 agrave 5 g selles

Triturer stoker

Conservation beaucoups plus longue des

formes veacutegeacutetatives et les kystes de protozoaires

Meacutelange fixateur agrave lrsquoalcool polyvinylique APV

APV

-alcool polyvinylique en poudre

5g

-glyceacuterol 15ml

-eau distilleacutee 625 ml

un bain marie ( 70 -75degC)10mn

Fixateur de Schaudinn modifieacute

-cristaux de clorure de mercure HgCl2

15g

-ethanol agrave 95 31 ml

Acide aceacutetique glacial 5ml +

2 agrave 3 mn

-Bonne conservation

-Une fixtion permettant de pratiquer des

frottis pouvant etre coloreacutes

Concervation des vers

Neacutematotes

Treacutematodes

cestodes

+ eau physiologique Entre 2 lames

Plongeacutes dan un fixteur

Ex - alcool 70 bouillant

- meacutelange alcool et formol

Aspect normal de la selle - poids de 110 agrave 150 g

- couleur brune

- Une consistance ferme et un aspect mouleacute

-- Un pH drsquoenviron 7

Microscopiquement en doit observeacute

-- Des fibres musculaires

-- De la cellulose non digestible poils vaisseaux

ligneux eacuteleacutements scleacutereux

-- de lrsquoamidon si le reacutegime est riche en feacuteculents et chez

lrsquoenfant

-- Quelques masses amorphes ou disques radieacutes ( les

savons)

-- il ne doit pas avoir de globules gras ( graisses

neutres)

COPROLOGIE PARASITAIRE Conduite de lrsquoexamen

1048766 Examen macroscopique

1048766 Examen microscopique

- Examen direct sans concentration

- Examen direct apreacutes concentration

- Les meacutethodes physiques

- Techniques de flottation

- Techniques de seacutedimentation

- Les meacutethodes physico-chimiques

- Les meacutethodes combineacutees

-Colorations speacutecifiques

- cultures

- Examens particuliers

Lrsquoobservation macroscopique Il permet de noter

- Couleur ( brune jaune ou ocre verte

deacutecoloreacutee noire rouge)

- consistance (molle dure liquide)

- aspect (preacutesence de bulles ou de gras

steacuteatorrheacutee)

- Preacutesence drsquoeacuteleacutements surajouteacutes

-Parasites adulte drsquoAscaris femelle drsquooxuyre

anneau ou chaine de taenia

-glaire (mucus)

-sang de pus

Lrsquoexamen direct sans concentration -Lexamen direct est le seule examen qui permet drsquoappreacutecier la vitaliteacute des

parasites

-Il met en eacutevidence les kystes et les formes veacutegeacutetatives de protozoaires ainsi

quelques oeufs et les larves dhelminthes

- On peut rajouter du Lugol double sur la lame qui fixe et colore les

structure nucleacuteaires

- Quelque soit le reacutesultat de lrsquoexamen direct on doit obligatoirement le

compleacuteter par deux techniques de concentration lrsquoune pour les kystes et

lrsquoautre pour les oeufs

- Il est impeacuteratif de connaitre la deacutescription des eacuteleacutements parasitaire et

de retenir les possibles faux parasites

Lrsquoobservation microscopique

une noisette de selle

(agrave diffeacuterents endroits)

lrsquoeau physiologique

agrave 09

suspension homogegravene

2 gouttes sur une

lame recouvrir par

une lamelle

lecture en

zig-zag x10

x 40

+

Les meacutethodes de concentrations

Les techniques par lesquelles on

essaie agrave partir de la grande quantiteacute

de la matieres feacutecales recueillies

drsquoobtenir dans un faible volume les

œufs larves kystes voire formes

veacutegeacutetatifs fixeacutees de parasites par

eacutelimination des reacutesidus de la

digestion

Les meacutethodes physiques

Les selles dilueacutees dans un reacuteactif de densiteacute

diffeacuterente de celle de parasite

DR superieur DP = flottation

DR inferieur DP = seacutedimentation

A-Techniques de flottation

Crsquoest une technique part du principe que la densiteacute du liquide et supeacuterieur

agrave celle des parasites ces derniers plus leacutegers flottent agrave la surface

Les principales techniques de flottation

- Meacutethode de Fullborn (1920) elle utilise une solution satureacutee de NaCl

(NaCl 250g ED 750ml d=12)

- Meacutethode de Willis (1921) simple et utilisable en routine

bullDiluer une noisette de selle dans la solution satureacutee de NaCl agrave 25

bullRemplissez un tube en verre conique jusquagrave sonbord en formant un

meacutenisque concave (verre de montre) sur lequel on deacutepose une lamelle

pendant 15 minutes (pas plus pour eacuteviter la cristalisation des oeufs) On la

deacutepose ensuite sur une lame porte objet et on observe agrave lrsquoobjectif X10 agrave la

recherche des OEufs drsquohelminthes tels que ceux drsquoHymenolepis ou

drsquoAnkylstomes

-Meacutethode de Janeckso et Urbanyi(1931) utilise comme reacuteactif une

solution de domercurate de potassium ( d=114) qui doit etre manipuleacutee

avec prudence

Iodo-mercurate de potassium

Bi iodure de mercure 100g

Iodure de potassium 74g

Eau distilleacutee 50 ml

-Meacutethode de Faust (1938) on centrifuge agrave 1500 tm une dilution des

selles dans lrsquoeau ordinaire tieacutede et on rejette le surnageant et on remet le

culot en suspension dans drsquoeau On reacutepegravete lrsquoopeacuteration jusqursquoagrave ce que le

surnageant soit limpide on remet alors le culot en suspension dans le

sulfate de Zink agrave 33 Apreacutes centrifugation on preacutelegraveve agrave lrsquoanse de

platine la pellicule de surfase qursquoon examine au microscope

- Meacutethode drsquoOtto Hwitt et Straham (1941) on procegravede de la meme

maniere que pour le Willis mais avec une solution aqueuse de sulfate

de Zink agrave 33 D=118

Avantage -Technique simple

-Mateacuteriel rudimentaire

- reacutealisation en seacuterie

-Sensibiliteacute treacutes bonne++++

Inconveacutenient

-Elle a ce pendant lrsquoinconveacutenient drsquoalteacuterer des Larves et les

Kystes pour les quels elle est contre-indiqueacutee ( reactifs

hypertoniques) de mecircme que pour les selles liquides ou

riches en lipides

-Elle donne de bons reacutesultats pour les oeufs drsquohelminthes

leacutegers (oeufs drsquoHymenolepis drsquoAnkylostome et deTaelignia)

B-Techniques de seacutedimentation bullLe diluant a une densiteacute inferieure agrave celle du

parasite alors se dernier se seacutedimente

Les principales techniques

- Meacutethode par seacutedimentation simple

- Meacutethode de Faust et IngallsReacutealiseacutee en utilisant

lrsquoeau glyceacuterineacutee (Eau + Glyceacuterine agrave 05) elle

permet drsquoaugmenter la mouillabiliteacute qui facilite la

seacutedimentation des parasites larves Anguillules

Œufs drsquoAscaris non feacutecondeacutes et œufs de

Schistosoma mansoni

-Meacutethode de Baroody et MostSeacutedimentation

centrifugation Eau de robinet chauffeacutee agrave 42degC

- Meacutethode de Jahnes et Hodges

Avantage -Technique simple

-Mateacuteriel rudimentaire

- reacutealisation en seacuterie

- Traitent une grande masse feacutecale ( parasites rares ou irreacuteguliegraverere ment

repartis dans la selle)

Inconveacutenient -une technique longue agrave reacutealiser

-Les cellules veacutegeacutetales seacutedimentent aussi vite que les parasites (Preacutesence

de certains reacutesidus)

-Non indiqueacutes en routine (sensibiliteacute

moyenne++)

Meacutethodes physico-chimiques ou

Diphasiques Caracteacuteriseacutees par la mise en preacutesence de deux

phases non miscibles lrsquoune aqueuse et lrsquoautre

constitueacutee par lrsquoeacutether qui est un solvant des lipidesil

se creacutee un coefficient de partage entre ces deux

phases et la reacutepartition de chaque eacuteleacutement feacutecal dans

chacune drsquoelles sera isoleacutes en fonction de son pouvoir

hydrophile ou lipophile

Bailenger a montreacute que le pH de la solution eacutetait

leacuteleacutement deacuteterminant pour la plus ou moins grande

efficaciteacute dune technique selon le parasite rechercheacute

Principes theacuteoriques

-Les selles tritureacutees (meacutelange au dixiegraveme environ) dans la solution choisie - elle peut ecirctre preacutealablement passeacutee sur un tamis pour eacuteliminer les gros deacutebris

le filtrat est verseacute dans un tube agrave centrifuger agrave fond conique en le remplissant 13

deacutether de maniegravere agrave ce quil y ai 23 du meacutelange selle en laissant 1 cm pour

fermer le tube

- Lrsquoagiter pendant une minute

- La suspension eacutetheacutero-liquide obtenue est centrifugeacutee agrave une vitesse lente de

lordre de 1500 agrave 2000 toursminute pendant une agrave trois minutes

- Apregraves centrifugation les constituants de la suspension sont reacutepartis en quatre

Couches

- Deacutecoller la couche des reacutesidus lipophiles agrave laide dune baguette de verre

- Retourner le tube au dessus de leacutevier (en faisant couler de leau) ou dun bac agrave

deacutechets liquides

- Essuyer les parois du tube avec un coton tenu agrave la pince en laissant toujours le

tube avec louverture dirigeacutee vers le bas pour eacuteviter de souiller le culot avec les

reacutesidus

- Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique pour

remettre en suspension le culot qui sera examineacute

- le culot qui nous inteacuteresse qui contient les eacuteleacutement parasitaires (kystes des

protozoaires)

Ether Debris

Phase aqueuse

Le culot

Les meacutethodes diphasiques sont

-Meacutethode de Telmann 1908

-Meacutethode De Rivas 1928

-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917

-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946

-Meacutethode De Ritchie 1948

-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood

-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf

-Meacutethode De Roman 1957

-Meacutethode de Bailenger 1962-1963

-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle

-Meacutethode de Junod 1927

Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage

Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia

Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)

La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble

lors de la centrifugation ce qui est un argument

diagnostique inteacuteressant

- Inconveacutenients

Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve

restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave

deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses

- Deacuteroulement de la technique

acide aceacutetique cristallisable 5 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethode de Bailenger - Avantages

Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et

des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5

(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)

- Inconveacutenients

Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre

technique est neacutecessaire

- Deacuteroulement de la technique

aceacutetate de sodium 15 g

acide aceacutetique 36 ml

eau distilleacutee qsp 1000 ml

Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide

dun pH-megravetre

Meacutethode de Ritchie simplifieacutee

- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles

formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour

enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les

oeufs dascaris et de schistosome

- Inconveacutenients

Le culot souvent volumineux est de lecture difficile

- Deacuteroulement de la technique

- Solutions de Ritchie

eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt

eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)

Meacutethode de Blagg et al

-Avantages

-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire

les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de

liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de

mercure souille les effluents du laboratoire

- Deacuteroulement de la technique

Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou

additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est

verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation

eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes

Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)

permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute

Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et

recommencer lagitation

On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et

cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee

Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages

-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles

Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes

aiseacutement et facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de

schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue

que les techniques en un temps

- Deacuteroulement de la technique

A) NaCl 9 g

formol officinal 10 ml

eau qsp 1000 ml

B) acide citrique 100 g

formol officinal 20 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethodes combineacutees

Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et

par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande

quantiteacute de selles

Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les

rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des

formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale

- Inconveacutenients

Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez

mal - Deacuteroulement de la technique

A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml

formol officinal 100 ml

eau qsp 1 000 ml

B bromure de sodium cristalliseacute 622 g

eau distilleacutee 1000 ml

Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant

pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou

kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour

trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente

- Inconveacutenients

Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps

assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate

preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)

- Deacuteroulement de la technique

- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)

liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml

eau distilleacutee 334 ml

Concentration diphasique

(MIF ou Bailenger)

une solution de

sulfate de zinc

30 secondes agrave f v

dilueacute au quart avec ED

Examiner

Le culot

Examiner

Le culot

iodomercurate

de potassium

de densiteacute 15

dilueacute au quart avec ED

Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod

simplifieacutee) - Avantages

donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete

- Inconveacutenients

Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi

dune solution de iodomercurate

- Deacuteroulement de la technique

Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)

- aceacutetate de sodium 15 g

- acide aceacutetique cristallisable 20 ml

- formol 40 ml

-eau qsp 1000 ml

Solution B (densiteacute 140)

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 442 volumes

8 g de selles

50 ml de solution de NaCl agrave

85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min

Suspension homo

+Tamisage Examiner

Le culot

eacuteliminer

le surnageant

20 ml dune solution A

+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique

1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min

4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer

le surnageant

Examiner

Le culot

Meacutethode de seacutedimentation-flottation

pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves

- Inconveacutenients

Quand la teneur des selles en lipides est anormalement

eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de

graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique

Solution de densiteacute 135

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 520 volumes

la suspension feacutecale en

eau agrave 85 de NaCl

1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min

1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min

20 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacute

eacuteliminer

le surnageant

5 agrave 7 ml de solution diodomercurate

de potassium de densiteacute 135 20 ml deau

Examen du culot

Seacutedimentation-flottation au saccharose

pour protozoaires - Avantages

permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les

kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand

lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste

na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des

selles fixeacutees au MIF

- Inconveacutenients

Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et

flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De

plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre

que des sels de mercure sont encore utiliseacutes

-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose

saccharose 120 g

eau 200 ml

Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et

utiliser alors

saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml

Suspension homo

+Tamisage +

2 agrave 3 heures

50 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacutee

fraicircche

10 agrave 15 ml de la suspension

1800-2000 toursmin 90sec

rejeter le surnageant

L 1 en12humide

3 agrave 4 g de selles

Seacute

dim

en

tatio

n

8 agrave 10 ml de solution de saccharose

+ 05 ml de solution de chlorure

mercurique agrave 15 en ED

1000 toursmin 45 sec

deacutecanter le

surnageant

dans T2

L 2 en12humide

Flottation

T2 20 agrave 30 ml deau

2000 toursmin90 sec

L 3 en12humide

Preacutecipitation

Les colorations

utile en cas de doute lrsquoidentification des

kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces

des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires

coloreacutees

recommandeacutee pour la conservation de

mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre

laboratoire pour avis

indispensable pour le diagnostic de certains

parasites (Cryptosporides microsporides)

Meacutethodes de coloration rapides

(Colorations en tubes)

- Meacutethode de Bailenger et Faraggi

- Meacutethode de Sapro Lawless et

Strome

-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene

tamporeacute

-Meacutethode de Horkin

- Meacutethode de Sargeaut

-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero

Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de

Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-

formol Apregraves meacutelange

- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave

laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout

-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le

fond du tube

-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en

protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees

immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine

des noyaux est coloreacutee en brun par liode

Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent

donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol

sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement

leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes

- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou

directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension

de selles avec le colorant

Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des

protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux

apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs

jours

la coloration de Bailenger

Laisser pendant une nuit en contact

cristal violet 2 g

fuchsine basique 005 g

alcool agrave 95deg 20 ml

pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml

eau distilleacutee 100 ml

Coloration des frottis

Pour bien observer les structures nucleacuteaires et

garder des lames de reacutefeacuterence on

confectionne un frottis de selles humide et

eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en

- 3 temps fixation puis coloration puis

diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)

- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg

Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)

Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag

- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher

soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains

dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)

soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)

soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1

heure)

-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode

-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau

- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3

30 min agrave leacutetuve agrave 37deg

- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece

24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs

-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au

microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent

nettement

-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau

-Deacuteshydrater

-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est

poseacutee deacutefinitivement

- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les

trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure

des noyaux Les kystes apparaissent en bleu

pacircle avec des noyaux bien nets Cest une

technique facile agrave reacutealiser

- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible

- Plonger la lame dans le fixateur colorant de

Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures

- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au

baume de Canada ou au baume syntheacutetique

Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par

Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie

- Seacutechage

- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol

- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid

- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet

- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20

secondes en agitant

- Rinccedilage

-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5

- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100

- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert

Coloration des microscporidies

Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10

- Effectuer un frottis de la selle

- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de

meacutethanol

- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes

- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord

en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml

- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge

Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee

microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-

Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution

- Colorer pendant 3 heures

- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02

-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-

Rincer seacutecher et lire au grossissement x100

Coloration par Uvitex 2B

Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute

pour la chitine Met en eacutevidence les

microsporidie par une fluorescence

directe On obtient une

fluorescence bleue pale sur fond

noir

Scotch test anal ( test de Graham agrave

la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius

vermicularis ainsi que les anneaux ou les

oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors

de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est

appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant

toute toilette en position foetale ou genou

pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus

et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute

sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera

agrave lrsquoobjectif X10

NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les

parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que

la technique devra ecirctre faite avec des gants

ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite

pour eacuteviter la contamination par les oeufs

auto-infestant de lrsquooxyure

Meacutethodes speacuteciales

Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon

eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs

drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle

de la taille drsquoun petit pois

Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen

des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm

dans une quantiteacute de vert malachite agrave

3 (contre colorant) et de glyceacuterine

appliquer la bande sur la selle et sur la

lame renverser et appuyer sur la

paillasse

Methode de Kato-Katz quantitative

utilise un gabarie pour la selle

Meacutethode efficace pour la recherche

doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale

mais inutilisable pour les kytes et les

larves ainsi que les oeufs dankylostome

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

Meacutelange fixateur agrave lrsquoalcool polyvinylique APV

APV

-alcool polyvinylique en poudre

5g

-glyceacuterol 15ml

-eau distilleacutee 625 ml

un bain marie ( 70 -75degC)10mn

Fixateur de Schaudinn modifieacute

-cristaux de clorure de mercure HgCl2

15g

-ethanol agrave 95 31 ml

Acide aceacutetique glacial 5ml +

2 agrave 3 mn

-Bonne conservation

-Une fixtion permettant de pratiquer des

frottis pouvant etre coloreacutes

Concervation des vers

Neacutematotes

Treacutematodes

cestodes

+ eau physiologique Entre 2 lames

Plongeacutes dan un fixteur

Ex - alcool 70 bouillant

- meacutelange alcool et formol

Aspect normal de la selle - poids de 110 agrave 150 g

- couleur brune

- Une consistance ferme et un aspect mouleacute

-- Un pH drsquoenviron 7

Microscopiquement en doit observeacute

-- Des fibres musculaires

-- De la cellulose non digestible poils vaisseaux

ligneux eacuteleacutements scleacutereux

-- de lrsquoamidon si le reacutegime est riche en feacuteculents et chez

lrsquoenfant

-- Quelques masses amorphes ou disques radieacutes ( les

savons)

-- il ne doit pas avoir de globules gras ( graisses

neutres)

COPROLOGIE PARASITAIRE Conduite de lrsquoexamen

1048766 Examen macroscopique

1048766 Examen microscopique

- Examen direct sans concentration

- Examen direct apreacutes concentration

- Les meacutethodes physiques

- Techniques de flottation

- Techniques de seacutedimentation

- Les meacutethodes physico-chimiques

- Les meacutethodes combineacutees

-Colorations speacutecifiques

- cultures

- Examens particuliers

Lrsquoobservation macroscopique Il permet de noter

- Couleur ( brune jaune ou ocre verte

deacutecoloreacutee noire rouge)

- consistance (molle dure liquide)

- aspect (preacutesence de bulles ou de gras

steacuteatorrheacutee)

- Preacutesence drsquoeacuteleacutements surajouteacutes

-Parasites adulte drsquoAscaris femelle drsquooxuyre

anneau ou chaine de taenia

-glaire (mucus)

-sang de pus

Lrsquoexamen direct sans concentration -Lexamen direct est le seule examen qui permet drsquoappreacutecier la vitaliteacute des

parasites

-Il met en eacutevidence les kystes et les formes veacutegeacutetatives de protozoaires ainsi

quelques oeufs et les larves dhelminthes

- On peut rajouter du Lugol double sur la lame qui fixe et colore les

structure nucleacuteaires

- Quelque soit le reacutesultat de lrsquoexamen direct on doit obligatoirement le

compleacuteter par deux techniques de concentration lrsquoune pour les kystes et

lrsquoautre pour les oeufs

- Il est impeacuteratif de connaitre la deacutescription des eacuteleacutements parasitaire et

de retenir les possibles faux parasites

Lrsquoobservation microscopique

une noisette de selle

(agrave diffeacuterents endroits)

lrsquoeau physiologique

agrave 09

suspension homogegravene

2 gouttes sur une

lame recouvrir par

une lamelle

lecture en

zig-zag x10

x 40

+

Les meacutethodes de concentrations

Les techniques par lesquelles on

essaie agrave partir de la grande quantiteacute

de la matieres feacutecales recueillies

drsquoobtenir dans un faible volume les

œufs larves kystes voire formes

veacutegeacutetatifs fixeacutees de parasites par

eacutelimination des reacutesidus de la

digestion

Les meacutethodes physiques

Les selles dilueacutees dans un reacuteactif de densiteacute

diffeacuterente de celle de parasite

DR superieur DP = flottation

DR inferieur DP = seacutedimentation

A-Techniques de flottation

Crsquoest une technique part du principe que la densiteacute du liquide et supeacuterieur

agrave celle des parasites ces derniers plus leacutegers flottent agrave la surface

Les principales techniques de flottation

- Meacutethode de Fullborn (1920) elle utilise une solution satureacutee de NaCl

(NaCl 250g ED 750ml d=12)

- Meacutethode de Willis (1921) simple et utilisable en routine

bullDiluer une noisette de selle dans la solution satureacutee de NaCl agrave 25

bullRemplissez un tube en verre conique jusquagrave sonbord en formant un

meacutenisque concave (verre de montre) sur lequel on deacutepose une lamelle

pendant 15 minutes (pas plus pour eacuteviter la cristalisation des oeufs) On la

deacutepose ensuite sur une lame porte objet et on observe agrave lrsquoobjectif X10 agrave la

recherche des OEufs drsquohelminthes tels que ceux drsquoHymenolepis ou

drsquoAnkylstomes

-Meacutethode de Janeckso et Urbanyi(1931) utilise comme reacuteactif une

solution de domercurate de potassium ( d=114) qui doit etre manipuleacutee

avec prudence

Iodo-mercurate de potassium

Bi iodure de mercure 100g

Iodure de potassium 74g

Eau distilleacutee 50 ml

-Meacutethode de Faust (1938) on centrifuge agrave 1500 tm une dilution des

selles dans lrsquoeau ordinaire tieacutede et on rejette le surnageant et on remet le

culot en suspension dans drsquoeau On reacutepegravete lrsquoopeacuteration jusqursquoagrave ce que le

surnageant soit limpide on remet alors le culot en suspension dans le

sulfate de Zink agrave 33 Apreacutes centrifugation on preacutelegraveve agrave lrsquoanse de

platine la pellicule de surfase qursquoon examine au microscope

- Meacutethode drsquoOtto Hwitt et Straham (1941) on procegravede de la meme

maniere que pour le Willis mais avec une solution aqueuse de sulfate

de Zink agrave 33 D=118

Avantage -Technique simple

-Mateacuteriel rudimentaire

- reacutealisation en seacuterie

-Sensibiliteacute treacutes bonne++++

Inconveacutenient

-Elle a ce pendant lrsquoinconveacutenient drsquoalteacuterer des Larves et les

Kystes pour les quels elle est contre-indiqueacutee ( reactifs

hypertoniques) de mecircme que pour les selles liquides ou

riches en lipides

-Elle donne de bons reacutesultats pour les oeufs drsquohelminthes

leacutegers (oeufs drsquoHymenolepis drsquoAnkylostome et deTaelignia)

B-Techniques de seacutedimentation bullLe diluant a une densiteacute inferieure agrave celle du

parasite alors se dernier se seacutedimente

Les principales techniques

- Meacutethode par seacutedimentation simple

- Meacutethode de Faust et IngallsReacutealiseacutee en utilisant

lrsquoeau glyceacuterineacutee (Eau + Glyceacuterine agrave 05) elle

permet drsquoaugmenter la mouillabiliteacute qui facilite la

seacutedimentation des parasites larves Anguillules

Œufs drsquoAscaris non feacutecondeacutes et œufs de

Schistosoma mansoni

-Meacutethode de Baroody et MostSeacutedimentation

centrifugation Eau de robinet chauffeacutee agrave 42degC

- Meacutethode de Jahnes et Hodges

Avantage -Technique simple

-Mateacuteriel rudimentaire

- reacutealisation en seacuterie

- Traitent une grande masse feacutecale ( parasites rares ou irreacuteguliegraverere ment

repartis dans la selle)

Inconveacutenient -une technique longue agrave reacutealiser

-Les cellules veacutegeacutetales seacutedimentent aussi vite que les parasites (Preacutesence

de certains reacutesidus)

-Non indiqueacutes en routine (sensibiliteacute

moyenne++)

Meacutethodes physico-chimiques ou

Diphasiques Caracteacuteriseacutees par la mise en preacutesence de deux

phases non miscibles lrsquoune aqueuse et lrsquoautre

constitueacutee par lrsquoeacutether qui est un solvant des lipidesil

se creacutee un coefficient de partage entre ces deux

phases et la reacutepartition de chaque eacuteleacutement feacutecal dans

chacune drsquoelles sera isoleacutes en fonction de son pouvoir

hydrophile ou lipophile

Bailenger a montreacute que le pH de la solution eacutetait

leacuteleacutement deacuteterminant pour la plus ou moins grande

efficaciteacute dune technique selon le parasite rechercheacute

Principes theacuteoriques

-Les selles tritureacutees (meacutelange au dixiegraveme environ) dans la solution choisie - elle peut ecirctre preacutealablement passeacutee sur un tamis pour eacuteliminer les gros deacutebris

le filtrat est verseacute dans un tube agrave centrifuger agrave fond conique en le remplissant 13

deacutether de maniegravere agrave ce quil y ai 23 du meacutelange selle en laissant 1 cm pour

fermer le tube

- Lrsquoagiter pendant une minute

- La suspension eacutetheacutero-liquide obtenue est centrifugeacutee agrave une vitesse lente de

lordre de 1500 agrave 2000 toursminute pendant une agrave trois minutes

- Apregraves centrifugation les constituants de la suspension sont reacutepartis en quatre

Couches

- Deacutecoller la couche des reacutesidus lipophiles agrave laide dune baguette de verre

- Retourner le tube au dessus de leacutevier (en faisant couler de leau) ou dun bac agrave

deacutechets liquides

- Essuyer les parois du tube avec un coton tenu agrave la pince en laissant toujours le

tube avec louverture dirigeacutee vers le bas pour eacuteviter de souiller le culot avec les

reacutesidus

- Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique pour

remettre en suspension le culot qui sera examineacute

- le culot qui nous inteacuteresse qui contient les eacuteleacutement parasitaires (kystes des

protozoaires)

Ether Debris

Phase aqueuse

Le culot

Les meacutethodes diphasiques sont

-Meacutethode de Telmann 1908

-Meacutethode De Rivas 1928

-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917

-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946

-Meacutethode De Ritchie 1948

-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood

-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf

-Meacutethode De Roman 1957

-Meacutethode de Bailenger 1962-1963

-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle

-Meacutethode de Junod 1927

Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage

Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia

Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)

La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble

lors de la centrifugation ce qui est un argument

diagnostique inteacuteressant

- Inconveacutenients

Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve

restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave

deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses

- Deacuteroulement de la technique

acide aceacutetique cristallisable 5 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethode de Bailenger - Avantages

Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et

des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5

(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)

- Inconveacutenients

Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre

technique est neacutecessaire

- Deacuteroulement de la technique

aceacutetate de sodium 15 g

acide aceacutetique 36 ml

eau distilleacutee qsp 1000 ml

Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide

dun pH-megravetre

Meacutethode de Ritchie simplifieacutee

- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles

formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour

enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les

oeufs dascaris et de schistosome

- Inconveacutenients

Le culot souvent volumineux est de lecture difficile

- Deacuteroulement de la technique

- Solutions de Ritchie

eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt

eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)

Meacutethode de Blagg et al

-Avantages

-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire

les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de

liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de

mercure souille les effluents du laboratoire

- Deacuteroulement de la technique

Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou

additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est

verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation

eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes

Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)

permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute

Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et

recommencer lagitation

On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et

cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee

Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages

-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles

Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes

aiseacutement et facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de

schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue

que les techniques en un temps

- Deacuteroulement de la technique

A) NaCl 9 g

formol officinal 10 ml

eau qsp 1000 ml

B) acide citrique 100 g

formol officinal 20 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethodes combineacutees

Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et

par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande

quantiteacute de selles

Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les

rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des

formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale

- Inconveacutenients

Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez

mal - Deacuteroulement de la technique

A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml

formol officinal 100 ml

eau qsp 1 000 ml

B bromure de sodium cristalliseacute 622 g

eau distilleacutee 1000 ml

Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant

pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou

kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour

trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente

- Inconveacutenients

Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps

assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate

preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)

- Deacuteroulement de la technique

- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)

liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml

eau distilleacutee 334 ml

Concentration diphasique

(MIF ou Bailenger)

une solution de

sulfate de zinc

30 secondes agrave f v

dilueacute au quart avec ED

Examiner

Le culot

Examiner

Le culot

iodomercurate

de potassium

de densiteacute 15

dilueacute au quart avec ED

Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod

simplifieacutee) - Avantages

donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete

- Inconveacutenients

Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi

dune solution de iodomercurate

- Deacuteroulement de la technique

Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)

- aceacutetate de sodium 15 g

- acide aceacutetique cristallisable 20 ml

- formol 40 ml

-eau qsp 1000 ml

Solution B (densiteacute 140)

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 442 volumes

8 g de selles

50 ml de solution de NaCl agrave

85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min

Suspension homo

+Tamisage Examiner

Le culot

eacuteliminer

le surnageant

20 ml dune solution A

+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique

1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min

4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer

le surnageant

Examiner

Le culot

Meacutethode de seacutedimentation-flottation

pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves

- Inconveacutenients

Quand la teneur des selles en lipides est anormalement

eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de

graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique

Solution de densiteacute 135

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 520 volumes

la suspension feacutecale en

eau agrave 85 de NaCl

1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min

1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min

20 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacute

eacuteliminer

le surnageant

5 agrave 7 ml de solution diodomercurate

de potassium de densiteacute 135 20 ml deau

Examen du culot

Seacutedimentation-flottation au saccharose

pour protozoaires - Avantages

permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les

kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand

lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste

na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des

selles fixeacutees au MIF

- Inconveacutenients

Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et

flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De

plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre

que des sels de mercure sont encore utiliseacutes

-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose

saccharose 120 g

eau 200 ml

Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et

utiliser alors

saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml

Suspension homo

+Tamisage +

2 agrave 3 heures

50 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacutee

fraicircche

10 agrave 15 ml de la suspension

1800-2000 toursmin 90sec

rejeter le surnageant

L 1 en12humide

3 agrave 4 g de selles

Seacute

dim

en

tatio

n

8 agrave 10 ml de solution de saccharose

+ 05 ml de solution de chlorure

mercurique agrave 15 en ED

1000 toursmin 45 sec

deacutecanter le

surnageant

dans T2

L 2 en12humide

Flottation

T2 20 agrave 30 ml deau

2000 toursmin90 sec

L 3 en12humide

Preacutecipitation

Les colorations

utile en cas de doute lrsquoidentification des

kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces

des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires

coloreacutees

recommandeacutee pour la conservation de

mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre

laboratoire pour avis

indispensable pour le diagnostic de certains

parasites (Cryptosporides microsporides)

Meacutethodes de coloration rapides

(Colorations en tubes)

- Meacutethode de Bailenger et Faraggi

- Meacutethode de Sapro Lawless et

Strome

-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene

tamporeacute

-Meacutethode de Horkin

- Meacutethode de Sargeaut

-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero

Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de

Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-

formol Apregraves meacutelange

- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave

laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout

-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le

fond du tube

-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en

protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees

immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine

des noyaux est coloreacutee en brun par liode

Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent

donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol

sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement

leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes

- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou

directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension

de selles avec le colorant

Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des

protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux

apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs

jours

la coloration de Bailenger

Laisser pendant une nuit en contact

cristal violet 2 g

fuchsine basique 005 g

alcool agrave 95deg 20 ml

pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml

eau distilleacutee 100 ml

Coloration des frottis

Pour bien observer les structures nucleacuteaires et

garder des lames de reacutefeacuterence on

confectionne un frottis de selles humide et

eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en

- 3 temps fixation puis coloration puis

diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)

- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg

Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)

Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag

- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher

soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains

dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)

soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)

soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1

heure)

-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode

-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau

- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3

30 min agrave leacutetuve agrave 37deg

- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece

24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs

-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au

microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent

nettement

-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau

-Deacuteshydrater

-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est

poseacutee deacutefinitivement

- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les

trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure

des noyaux Les kystes apparaissent en bleu

pacircle avec des noyaux bien nets Cest une

technique facile agrave reacutealiser

- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible

- Plonger la lame dans le fixateur colorant de

Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures

- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au

baume de Canada ou au baume syntheacutetique

Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par

Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie

- Seacutechage

- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol

- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid

- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet

- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20

secondes en agitant

- Rinccedilage

-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5

- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100

- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert

Coloration des microscporidies

Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10

- Effectuer un frottis de la selle

- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de

meacutethanol

- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes

- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord

en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml

- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge

Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee

microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-

Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution

- Colorer pendant 3 heures

- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02

-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-

Rincer seacutecher et lire au grossissement x100

Coloration par Uvitex 2B

Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute

pour la chitine Met en eacutevidence les

microsporidie par une fluorescence

directe On obtient une

fluorescence bleue pale sur fond

noir

Scotch test anal ( test de Graham agrave

la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius

vermicularis ainsi que les anneaux ou les

oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors

de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est

appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant

toute toilette en position foetale ou genou

pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus

et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute

sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera

agrave lrsquoobjectif X10

NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les

parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que

la technique devra ecirctre faite avec des gants

ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite

pour eacuteviter la contamination par les oeufs

auto-infestant de lrsquooxyure

Meacutethodes speacuteciales

Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon

eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs

drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle

de la taille drsquoun petit pois

Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen

des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm

dans une quantiteacute de vert malachite agrave

3 (contre colorant) et de glyceacuterine

appliquer la bande sur la selle et sur la

lame renverser et appuyer sur la

paillasse

Methode de Kato-Katz quantitative

utilise un gabarie pour la selle

Meacutethode efficace pour la recherche

doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale

mais inutilisable pour les kytes et les

larves ainsi que les oeufs dankylostome

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

Concervation des vers

Neacutematotes

Treacutematodes

cestodes

+ eau physiologique Entre 2 lames

Plongeacutes dan un fixteur

Ex - alcool 70 bouillant

- meacutelange alcool et formol

Aspect normal de la selle - poids de 110 agrave 150 g

- couleur brune

- Une consistance ferme et un aspect mouleacute

-- Un pH drsquoenviron 7

Microscopiquement en doit observeacute

-- Des fibres musculaires

-- De la cellulose non digestible poils vaisseaux

ligneux eacuteleacutements scleacutereux

-- de lrsquoamidon si le reacutegime est riche en feacuteculents et chez

lrsquoenfant

-- Quelques masses amorphes ou disques radieacutes ( les

savons)

-- il ne doit pas avoir de globules gras ( graisses

neutres)

COPROLOGIE PARASITAIRE Conduite de lrsquoexamen

1048766 Examen macroscopique

1048766 Examen microscopique

- Examen direct sans concentration

- Examen direct apreacutes concentration

- Les meacutethodes physiques

- Techniques de flottation

- Techniques de seacutedimentation

- Les meacutethodes physico-chimiques

- Les meacutethodes combineacutees

-Colorations speacutecifiques

- cultures

- Examens particuliers

Lrsquoobservation macroscopique Il permet de noter

- Couleur ( brune jaune ou ocre verte

deacutecoloreacutee noire rouge)

- consistance (molle dure liquide)

- aspect (preacutesence de bulles ou de gras

steacuteatorrheacutee)

- Preacutesence drsquoeacuteleacutements surajouteacutes

-Parasites adulte drsquoAscaris femelle drsquooxuyre

anneau ou chaine de taenia

-glaire (mucus)

-sang de pus

Lrsquoexamen direct sans concentration -Lexamen direct est le seule examen qui permet drsquoappreacutecier la vitaliteacute des

parasites

-Il met en eacutevidence les kystes et les formes veacutegeacutetatives de protozoaires ainsi

quelques oeufs et les larves dhelminthes

- On peut rajouter du Lugol double sur la lame qui fixe et colore les

structure nucleacuteaires

- Quelque soit le reacutesultat de lrsquoexamen direct on doit obligatoirement le

compleacuteter par deux techniques de concentration lrsquoune pour les kystes et

lrsquoautre pour les oeufs

- Il est impeacuteratif de connaitre la deacutescription des eacuteleacutements parasitaire et

de retenir les possibles faux parasites

Lrsquoobservation microscopique

une noisette de selle

(agrave diffeacuterents endroits)

lrsquoeau physiologique

agrave 09

suspension homogegravene

2 gouttes sur une

lame recouvrir par

une lamelle

lecture en

zig-zag x10

x 40

+

Les meacutethodes de concentrations

Les techniques par lesquelles on

essaie agrave partir de la grande quantiteacute

de la matieres feacutecales recueillies

drsquoobtenir dans un faible volume les

œufs larves kystes voire formes

veacutegeacutetatifs fixeacutees de parasites par

eacutelimination des reacutesidus de la

digestion

Les meacutethodes physiques

Les selles dilueacutees dans un reacuteactif de densiteacute

diffeacuterente de celle de parasite

DR superieur DP = flottation

DR inferieur DP = seacutedimentation

A-Techniques de flottation

Crsquoest une technique part du principe que la densiteacute du liquide et supeacuterieur

agrave celle des parasites ces derniers plus leacutegers flottent agrave la surface

Les principales techniques de flottation

- Meacutethode de Fullborn (1920) elle utilise une solution satureacutee de NaCl

(NaCl 250g ED 750ml d=12)

- Meacutethode de Willis (1921) simple et utilisable en routine

bullDiluer une noisette de selle dans la solution satureacutee de NaCl agrave 25

bullRemplissez un tube en verre conique jusquagrave sonbord en formant un

meacutenisque concave (verre de montre) sur lequel on deacutepose une lamelle

pendant 15 minutes (pas plus pour eacuteviter la cristalisation des oeufs) On la

deacutepose ensuite sur une lame porte objet et on observe agrave lrsquoobjectif X10 agrave la

recherche des OEufs drsquohelminthes tels que ceux drsquoHymenolepis ou

drsquoAnkylstomes

-Meacutethode de Janeckso et Urbanyi(1931) utilise comme reacuteactif une

solution de domercurate de potassium ( d=114) qui doit etre manipuleacutee

avec prudence

Iodo-mercurate de potassium

Bi iodure de mercure 100g

Iodure de potassium 74g

Eau distilleacutee 50 ml

-Meacutethode de Faust (1938) on centrifuge agrave 1500 tm une dilution des

selles dans lrsquoeau ordinaire tieacutede et on rejette le surnageant et on remet le

culot en suspension dans drsquoeau On reacutepegravete lrsquoopeacuteration jusqursquoagrave ce que le

surnageant soit limpide on remet alors le culot en suspension dans le

sulfate de Zink agrave 33 Apreacutes centrifugation on preacutelegraveve agrave lrsquoanse de

platine la pellicule de surfase qursquoon examine au microscope

- Meacutethode drsquoOtto Hwitt et Straham (1941) on procegravede de la meme

maniere que pour le Willis mais avec une solution aqueuse de sulfate

de Zink agrave 33 D=118

Avantage -Technique simple

-Mateacuteriel rudimentaire

- reacutealisation en seacuterie

-Sensibiliteacute treacutes bonne++++

Inconveacutenient

-Elle a ce pendant lrsquoinconveacutenient drsquoalteacuterer des Larves et les

Kystes pour les quels elle est contre-indiqueacutee ( reactifs

hypertoniques) de mecircme que pour les selles liquides ou

riches en lipides

-Elle donne de bons reacutesultats pour les oeufs drsquohelminthes

leacutegers (oeufs drsquoHymenolepis drsquoAnkylostome et deTaelignia)

B-Techniques de seacutedimentation bullLe diluant a une densiteacute inferieure agrave celle du

parasite alors se dernier se seacutedimente

Les principales techniques

- Meacutethode par seacutedimentation simple

- Meacutethode de Faust et IngallsReacutealiseacutee en utilisant

lrsquoeau glyceacuterineacutee (Eau + Glyceacuterine agrave 05) elle

permet drsquoaugmenter la mouillabiliteacute qui facilite la

seacutedimentation des parasites larves Anguillules

Œufs drsquoAscaris non feacutecondeacutes et œufs de

Schistosoma mansoni

-Meacutethode de Baroody et MostSeacutedimentation

centrifugation Eau de robinet chauffeacutee agrave 42degC

- Meacutethode de Jahnes et Hodges

Avantage -Technique simple

-Mateacuteriel rudimentaire

- reacutealisation en seacuterie

- Traitent une grande masse feacutecale ( parasites rares ou irreacuteguliegraverere ment

repartis dans la selle)

Inconveacutenient -une technique longue agrave reacutealiser

-Les cellules veacutegeacutetales seacutedimentent aussi vite que les parasites (Preacutesence

de certains reacutesidus)

-Non indiqueacutes en routine (sensibiliteacute

moyenne++)

Meacutethodes physico-chimiques ou

Diphasiques Caracteacuteriseacutees par la mise en preacutesence de deux

phases non miscibles lrsquoune aqueuse et lrsquoautre

constitueacutee par lrsquoeacutether qui est un solvant des lipidesil

se creacutee un coefficient de partage entre ces deux

phases et la reacutepartition de chaque eacuteleacutement feacutecal dans

chacune drsquoelles sera isoleacutes en fonction de son pouvoir

hydrophile ou lipophile

Bailenger a montreacute que le pH de la solution eacutetait

leacuteleacutement deacuteterminant pour la plus ou moins grande

efficaciteacute dune technique selon le parasite rechercheacute

Principes theacuteoriques

-Les selles tritureacutees (meacutelange au dixiegraveme environ) dans la solution choisie - elle peut ecirctre preacutealablement passeacutee sur un tamis pour eacuteliminer les gros deacutebris

le filtrat est verseacute dans un tube agrave centrifuger agrave fond conique en le remplissant 13

deacutether de maniegravere agrave ce quil y ai 23 du meacutelange selle en laissant 1 cm pour

fermer le tube

- Lrsquoagiter pendant une minute

- La suspension eacutetheacutero-liquide obtenue est centrifugeacutee agrave une vitesse lente de

lordre de 1500 agrave 2000 toursminute pendant une agrave trois minutes

- Apregraves centrifugation les constituants de la suspension sont reacutepartis en quatre

Couches

- Deacutecoller la couche des reacutesidus lipophiles agrave laide dune baguette de verre

- Retourner le tube au dessus de leacutevier (en faisant couler de leau) ou dun bac agrave

deacutechets liquides

- Essuyer les parois du tube avec un coton tenu agrave la pince en laissant toujours le

tube avec louverture dirigeacutee vers le bas pour eacuteviter de souiller le culot avec les

reacutesidus

- Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique pour

remettre en suspension le culot qui sera examineacute

- le culot qui nous inteacuteresse qui contient les eacuteleacutement parasitaires (kystes des

protozoaires)

Ether Debris

Phase aqueuse

Le culot

Les meacutethodes diphasiques sont

-Meacutethode de Telmann 1908

-Meacutethode De Rivas 1928

-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917

-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946

-Meacutethode De Ritchie 1948

-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood

-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf

-Meacutethode De Roman 1957

-Meacutethode de Bailenger 1962-1963

-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle

-Meacutethode de Junod 1927

Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage

Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia

Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)

La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble

lors de la centrifugation ce qui est un argument

diagnostique inteacuteressant

- Inconveacutenients

Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve

restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave

deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses

- Deacuteroulement de la technique

acide aceacutetique cristallisable 5 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethode de Bailenger - Avantages

Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et

des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5

(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)

- Inconveacutenients

Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre

technique est neacutecessaire

- Deacuteroulement de la technique

aceacutetate de sodium 15 g

acide aceacutetique 36 ml

eau distilleacutee qsp 1000 ml

Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide

dun pH-megravetre

Meacutethode de Ritchie simplifieacutee

- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles

formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour

enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les

oeufs dascaris et de schistosome

- Inconveacutenients

Le culot souvent volumineux est de lecture difficile

- Deacuteroulement de la technique

- Solutions de Ritchie

eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt

eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)

Meacutethode de Blagg et al

-Avantages

-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire

les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de

liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de

mercure souille les effluents du laboratoire

- Deacuteroulement de la technique

Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou

additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est

verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation

eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes

Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)

permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute

Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et

recommencer lagitation

On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et

cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee

Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages

-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles

Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes

aiseacutement et facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de

schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue

que les techniques en un temps

- Deacuteroulement de la technique

A) NaCl 9 g

formol officinal 10 ml

eau qsp 1000 ml

B) acide citrique 100 g

formol officinal 20 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethodes combineacutees

Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et

par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande

quantiteacute de selles

Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les

rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des

formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale

- Inconveacutenients

Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez

mal - Deacuteroulement de la technique

A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml

formol officinal 100 ml

eau qsp 1 000 ml

B bromure de sodium cristalliseacute 622 g

eau distilleacutee 1000 ml

Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant

pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou

kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour

trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente

- Inconveacutenients

Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps

assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate

preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)

- Deacuteroulement de la technique

- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)

liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml

eau distilleacutee 334 ml

Concentration diphasique

(MIF ou Bailenger)

une solution de

sulfate de zinc

30 secondes agrave f v

dilueacute au quart avec ED

Examiner

Le culot

Examiner

Le culot

iodomercurate

de potassium

de densiteacute 15

dilueacute au quart avec ED

Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod

simplifieacutee) - Avantages

donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete

- Inconveacutenients

Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi

dune solution de iodomercurate

- Deacuteroulement de la technique

Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)

- aceacutetate de sodium 15 g

- acide aceacutetique cristallisable 20 ml

- formol 40 ml

-eau qsp 1000 ml

Solution B (densiteacute 140)

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 442 volumes

8 g de selles

50 ml de solution de NaCl agrave

85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min

Suspension homo

+Tamisage Examiner

Le culot

eacuteliminer

le surnageant

20 ml dune solution A

+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique

1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min

4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer

le surnageant

Examiner

Le culot

Meacutethode de seacutedimentation-flottation

pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves

- Inconveacutenients

Quand la teneur des selles en lipides est anormalement

eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de

graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique

Solution de densiteacute 135

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 520 volumes

la suspension feacutecale en

eau agrave 85 de NaCl

1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min

1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min

20 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacute

eacuteliminer

le surnageant

5 agrave 7 ml de solution diodomercurate

de potassium de densiteacute 135 20 ml deau

Examen du culot

Seacutedimentation-flottation au saccharose

pour protozoaires - Avantages

permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les

kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand

lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste

na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des

selles fixeacutees au MIF

- Inconveacutenients

Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et

flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De

plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre

que des sels de mercure sont encore utiliseacutes

-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose

saccharose 120 g

eau 200 ml

Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et

utiliser alors

saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml

Suspension homo

+Tamisage +

2 agrave 3 heures

50 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacutee

fraicircche

10 agrave 15 ml de la suspension

1800-2000 toursmin 90sec

rejeter le surnageant

L 1 en12humide

3 agrave 4 g de selles

Seacute

dim

en

tatio

n

8 agrave 10 ml de solution de saccharose

+ 05 ml de solution de chlorure

mercurique agrave 15 en ED

1000 toursmin 45 sec

deacutecanter le

surnageant

dans T2

L 2 en12humide

Flottation

T2 20 agrave 30 ml deau

2000 toursmin90 sec

L 3 en12humide

Preacutecipitation

Les colorations

utile en cas de doute lrsquoidentification des

kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces

des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires

coloreacutees

recommandeacutee pour la conservation de

mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre

laboratoire pour avis

indispensable pour le diagnostic de certains

parasites (Cryptosporides microsporides)

Meacutethodes de coloration rapides

(Colorations en tubes)

- Meacutethode de Bailenger et Faraggi

- Meacutethode de Sapro Lawless et

Strome

-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene

tamporeacute

-Meacutethode de Horkin

- Meacutethode de Sargeaut

-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero

Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de

Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-

formol Apregraves meacutelange

- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave

laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout

-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le

fond du tube

-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en

protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees

immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine

des noyaux est coloreacutee en brun par liode

Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent

donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol

sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement

leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes

- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou

directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension

de selles avec le colorant

Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des

protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux

apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs

jours

la coloration de Bailenger

Laisser pendant une nuit en contact

cristal violet 2 g

fuchsine basique 005 g

alcool agrave 95deg 20 ml

pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml

eau distilleacutee 100 ml

Coloration des frottis

Pour bien observer les structures nucleacuteaires et

garder des lames de reacutefeacuterence on

confectionne un frottis de selles humide et

eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en

- 3 temps fixation puis coloration puis

diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)

- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg

Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)

Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag

- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher

soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains

dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)

soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)

soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1

heure)

-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode

-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau

- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3

30 min agrave leacutetuve agrave 37deg

- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece

24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs

-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au

microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent

nettement

-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau

-Deacuteshydrater

-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est

poseacutee deacutefinitivement

- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les

trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure

des noyaux Les kystes apparaissent en bleu

pacircle avec des noyaux bien nets Cest une

technique facile agrave reacutealiser

- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible

- Plonger la lame dans le fixateur colorant de

Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures

- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au

baume de Canada ou au baume syntheacutetique

Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par

Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie

- Seacutechage

- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol

- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid

- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet

- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20

secondes en agitant

- Rinccedilage

-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5

- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100

- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert

Coloration des microscporidies

Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10

- Effectuer un frottis de la selle

- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de

meacutethanol

- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes

- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord

en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml

- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge

Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee

microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-

Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution

- Colorer pendant 3 heures

- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02

-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-

Rincer seacutecher et lire au grossissement x100

Coloration par Uvitex 2B

Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute

pour la chitine Met en eacutevidence les

microsporidie par une fluorescence

directe On obtient une

fluorescence bleue pale sur fond

noir

Scotch test anal ( test de Graham agrave

la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius

vermicularis ainsi que les anneaux ou les

oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors

de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est

appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant

toute toilette en position foetale ou genou

pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus

et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute

sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera

agrave lrsquoobjectif X10

NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les

parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que

la technique devra ecirctre faite avec des gants

ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite

pour eacuteviter la contamination par les oeufs

auto-infestant de lrsquooxyure

Meacutethodes speacuteciales

Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon

eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs

drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle

de la taille drsquoun petit pois

Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen

des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm

dans une quantiteacute de vert malachite agrave

3 (contre colorant) et de glyceacuterine

appliquer la bande sur la selle et sur la

lame renverser et appuyer sur la

paillasse

Methode de Kato-Katz quantitative

utilise un gabarie pour la selle

Meacutethode efficace pour la recherche

doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale

mais inutilisable pour les kytes et les

larves ainsi que les oeufs dankylostome

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

Aspect normal de la selle - poids de 110 agrave 150 g

- couleur brune

- Une consistance ferme et un aspect mouleacute

-- Un pH drsquoenviron 7

Microscopiquement en doit observeacute

-- Des fibres musculaires

-- De la cellulose non digestible poils vaisseaux

ligneux eacuteleacutements scleacutereux

-- de lrsquoamidon si le reacutegime est riche en feacuteculents et chez

lrsquoenfant

-- Quelques masses amorphes ou disques radieacutes ( les

savons)

-- il ne doit pas avoir de globules gras ( graisses

neutres)

COPROLOGIE PARASITAIRE Conduite de lrsquoexamen

1048766 Examen macroscopique

1048766 Examen microscopique

- Examen direct sans concentration

- Examen direct apreacutes concentration

- Les meacutethodes physiques

- Techniques de flottation

- Techniques de seacutedimentation

- Les meacutethodes physico-chimiques

- Les meacutethodes combineacutees

-Colorations speacutecifiques

- cultures

- Examens particuliers

Lrsquoobservation macroscopique Il permet de noter

- Couleur ( brune jaune ou ocre verte

deacutecoloreacutee noire rouge)

- consistance (molle dure liquide)

- aspect (preacutesence de bulles ou de gras

steacuteatorrheacutee)

- Preacutesence drsquoeacuteleacutements surajouteacutes

-Parasites adulte drsquoAscaris femelle drsquooxuyre

anneau ou chaine de taenia

-glaire (mucus)

-sang de pus

Lrsquoexamen direct sans concentration -Lexamen direct est le seule examen qui permet drsquoappreacutecier la vitaliteacute des

parasites

-Il met en eacutevidence les kystes et les formes veacutegeacutetatives de protozoaires ainsi

quelques oeufs et les larves dhelminthes

- On peut rajouter du Lugol double sur la lame qui fixe et colore les

structure nucleacuteaires

- Quelque soit le reacutesultat de lrsquoexamen direct on doit obligatoirement le

compleacuteter par deux techniques de concentration lrsquoune pour les kystes et

lrsquoautre pour les oeufs

- Il est impeacuteratif de connaitre la deacutescription des eacuteleacutements parasitaire et

de retenir les possibles faux parasites

Lrsquoobservation microscopique

une noisette de selle

(agrave diffeacuterents endroits)

lrsquoeau physiologique

agrave 09

suspension homogegravene

2 gouttes sur une

lame recouvrir par

une lamelle

lecture en

zig-zag x10

x 40

+

Les meacutethodes de concentrations

Les techniques par lesquelles on

essaie agrave partir de la grande quantiteacute

de la matieres feacutecales recueillies

drsquoobtenir dans un faible volume les

œufs larves kystes voire formes

veacutegeacutetatifs fixeacutees de parasites par

eacutelimination des reacutesidus de la

digestion

Les meacutethodes physiques

Les selles dilueacutees dans un reacuteactif de densiteacute

diffeacuterente de celle de parasite

DR superieur DP = flottation

DR inferieur DP = seacutedimentation

A-Techniques de flottation

Crsquoest une technique part du principe que la densiteacute du liquide et supeacuterieur

agrave celle des parasites ces derniers plus leacutegers flottent agrave la surface

Les principales techniques de flottation

- Meacutethode de Fullborn (1920) elle utilise une solution satureacutee de NaCl

(NaCl 250g ED 750ml d=12)

- Meacutethode de Willis (1921) simple et utilisable en routine

bullDiluer une noisette de selle dans la solution satureacutee de NaCl agrave 25

bullRemplissez un tube en verre conique jusquagrave sonbord en formant un

meacutenisque concave (verre de montre) sur lequel on deacutepose une lamelle

pendant 15 minutes (pas plus pour eacuteviter la cristalisation des oeufs) On la

deacutepose ensuite sur une lame porte objet et on observe agrave lrsquoobjectif X10 agrave la

recherche des OEufs drsquohelminthes tels que ceux drsquoHymenolepis ou

drsquoAnkylstomes

-Meacutethode de Janeckso et Urbanyi(1931) utilise comme reacuteactif une

solution de domercurate de potassium ( d=114) qui doit etre manipuleacutee

avec prudence

Iodo-mercurate de potassium

Bi iodure de mercure 100g

Iodure de potassium 74g

Eau distilleacutee 50 ml

-Meacutethode de Faust (1938) on centrifuge agrave 1500 tm une dilution des

selles dans lrsquoeau ordinaire tieacutede et on rejette le surnageant et on remet le

culot en suspension dans drsquoeau On reacutepegravete lrsquoopeacuteration jusqursquoagrave ce que le

surnageant soit limpide on remet alors le culot en suspension dans le

sulfate de Zink agrave 33 Apreacutes centrifugation on preacutelegraveve agrave lrsquoanse de

platine la pellicule de surfase qursquoon examine au microscope

- Meacutethode drsquoOtto Hwitt et Straham (1941) on procegravede de la meme

maniere que pour le Willis mais avec une solution aqueuse de sulfate

de Zink agrave 33 D=118

Avantage -Technique simple

-Mateacuteriel rudimentaire

- reacutealisation en seacuterie

-Sensibiliteacute treacutes bonne++++

Inconveacutenient

-Elle a ce pendant lrsquoinconveacutenient drsquoalteacuterer des Larves et les

Kystes pour les quels elle est contre-indiqueacutee ( reactifs

hypertoniques) de mecircme que pour les selles liquides ou

riches en lipides

-Elle donne de bons reacutesultats pour les oeufs drsquohelminthes

leacutegers (oeufs drsquoHymenolepis drsquoAnkylostome et deTaelignia)

B-Techniques de seacutedimentation bullLe diluant a une densiteacute inferieure agrave celle du

parasite alors se dernier se seacutedimente

Les principales techniques

- Meacutethode par seacutedimentation simple

- Meacutethode de Faust et IngallsReacutealiseacutee en utilisant

lrsquoeau glyceacuterineacutee (Eau + Glyceacuterine agrave 05) elle

permet drsquoaugmenter la mouillabiliteacute qui facilite la

seacutedimentation des parasites larves Anguillules

Œufs drsquoAscaris non feacutecondeacutes et œufs de

Schistosoma mansoni

-Meacutethode de Baroody et MostSeacutedimentation

centrifugation Eau de robinet chauffeacutee agrave 42degC

- Meacutethode de Jahnes et Hodges

Avantage -Technique simple

-Mateacuteriel rudimentaire

- reacutealisation en seacuterie

- Traitent une grande masse feacutecale ( parasites rares ou irreacuteguliegraverere ment

repartis dans la selle)

Inconveacutenient -une technique longue agrave reacutealiser

-Les cellules veacutegeacutetales seacutedimentent aussi vite que les parasites (Preacutesence

de certains reacutesidus)

-Non indiqueacutes en routine (sensibiliteacute

moyenne++)

Meacutethodes physico-chimiques ou

Diphasiques Caracteacuteriseacutees par la mise en preacutesence de deux

phases non miscibles lrsquoune aqueuse et lrsquoautre

constitueacutee par lrsquoeacutether qui est un solvant des lipidesil

se creacutee un coefficient de partage entre ces deux

phases et la reacutepartition de chaque eacuteleacutement feacutecal dans

chacune drsquoelles sera isoleacutes en fonction de son pouvoir

hydrophile ou lipophile

Bailenger a montreacute que le pH de la solution eacutetait

leacuteleacutement deacuteterminant pour la plus ou moins grande

efficaciteacute dune technique selon le parasite rechercheacute

Principes theacuteoriques

-Les selles tritureacutees (meacutelange au dixiegraveme environ) dans la solution choisie - elle peut ecirctre preacutealablement passeacutee sur un tamis pour eacuteliminer les gros deacutebris

le filtrat est verseacute dans un tube agrave centrifuger agrave fond conique en le remplissant 13

deacutether de maniegravere agrave ce quil y ai 23 du meacutelange selle en laissant 1 cm pour

fermer le tube

- Lrsquoagiter pendant une minute

- La suspension eacutetheacutero-liquide obtenue est centrifugeacutee agrave une vitesse lente de

lordre de 1500 agrave 2000 toursminute pendant une agrave trois minutes

- Apregraves centrifugation les constituants de la suspension sont reacutepartis en quatre

Couches

- Deacutecoller la couche des reacutesidus lipophiles agrave laide dune baguette de verre

- Retourner le tube au dessus de leacutevier (en faisant couler de leau) ou dun bac agrave

deacutechets liquides

- Essuyer les parois du tube avec un coton tenu agrave la pince en laissant toujours le

tube avec louverture dirigeacutee vers le bas pour eacuteviter de souiller le culot avec les

reacutesidus

- Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique pour

remettre en suspension le culot qui sera examineacute

- le culot qui nous inteacuteresse qui contient les eacuteleacutement parasitaires (kystes des

protozoaires)

Ether Debris

Phase aqueuse

Le culot

Les meacutethodes diphasiques sont

-Meacutethode de Telmann 1908

-Meacutethode De Rivas 1928

-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917

-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946

-Meacutethode De Ritchie 1948

-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood

-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf

-Meacutethode De Roman 1957

-Meacutethode de Bailenger 1962-1963

-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle

-Meacutethode de Junod 1927

Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage

Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia

Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)

La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble

lors de la centrifugation ce qui est un argument

diagnostique inteacuteressant

- Inconveacutenients

Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve

restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave

deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses

- Deacuteroulement de la technique

acide aceacutetique cristallisable 5 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethode de Bailenger - Avantages

Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et

des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5

(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)

- Inconveacutenients

Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre

technique est neacutecessaire

- Deacuteroulement de la technique

aceacutetate de sodium 15 g

acide aceacutetique 36 ml

eau distilleacutee qsp 1000 ml

Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide

dun pH-megravetre

Meacutethode de Ritchie simplifieacutee

- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles

formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour

enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les

oeufs dascaris et de schistosome

- Inconveacutenients

Le culot souvent volumineux est de lecture difficile

- Deacuteroulement de la technique

- Solutions de Ritchie

eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt

eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)

Meacutethode de Blagg et al

-Avantages

-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire

les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de

liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de

mercure souille les effluents du laboratoire

- Deacuteroulement de la technique

Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou

additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est

verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation

eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes

Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)

permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute

Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et

recommencer lagitation

On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et

cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee

Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages

-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles

Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes

aiseacutement et facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de

schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue

que les techniques en un temps

- Deacuteroulement de la technique

A) NaCl 9 g

formol officinal 10 ml

eau qsp 1000 ml

B) acide citrique 100 g

formol officinal 20 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethodes combineacutees

Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et

par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande

quantiteacute de selles

Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les

rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des

formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale

- Inconveacutenients

Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez

mal - Deacuteroulement de la technique

A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml

formol officinal 100 ml

eau qsp 1 000 ml

B bromure de sodium cristalliseacute 622 g

eau distilleacutee 1000 ml

Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant

pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou

kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour

trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente

- Inconveacutenients

Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps

assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate

preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)

- Deacuteroulement de la technique

- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)

liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml

eau distilleacutee 334 ml

Concentration diphasique

(MIF ou Bailenger)

une solution de

sulfate de zinc

30 secondes agrave f v

dilueacute au quart avec ED

Examiner

Le culot

Examiner

Le culot

iodomercurate

de potassium

de densiteacute 15

dilueacute au quart avec ED

Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod

simplifieacutee) - Avantages

donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete

- Inconveacutenients

Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi

dune solution de iodomercurate

- Deacuteroulement de la technique

Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)

- aceacutetate de sodium 15 g

- acide aceacutetique cristallisable 20 ml

- formol 40 ml

-eau qsp 1000 ml

Solution B (densiteacute 140)

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 442 volumes

8 g de selles

50 ml de solution de NaCl agrave

85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min

Suspension homo

+Tamisage Examiner

Le culot

eacuteliminer

le surnageant

20 ml dune solution A

+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique

1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min

4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer

le surnageant

Examiner

Le culot

Meacutethode de seacutedimentation-flottation

pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves

- Inconveacutenients

Quand la teneur des selles en lipides est anormalement

eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de

graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique

Solution de densiteacute 135

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 520 volumes

la suspension feacutecale en

eau agrave 85 de NaCl

1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min

1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min

20 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacute

eacuteliminer

le surnageant

5 agrave 7 ml de solution diodomercurate

de potassium de densiteacute 135 20 ml deau

Examen du culot

Seacutedimentation-flottation au saccharose

pour protozoaires - Avantages

permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les

kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand

lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste

na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des

selles fixeacutees au MIF

- Inconveacutenients

Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et

flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De

plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre

que des sels de mercure sont encore utiliseacutes

-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose

saccharose 120 g

eau 200 ml

Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et

utiliser alors

saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml

Suspension homo

+Tamisage +

2 agrave 3 heures

50 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacutee

fraicircche

10 agrave 15 ml de la suspension

1800-2000 toursmin 90sec

rejeter le surnageant

L 1 en12humide

3 agrave 4 g de selles

Seacute

dim

en

tatio

n

8 agrave 10 ml de solution de saccharose

+ 05 ml de solution de chlorure

mercurique agrave 15 en ED

1000 toursmin 45 sec

deacutecanter le

surnageant

dans T2

L 2 en12humide

Flottation

T2 20 agrave 30 ml deau

2000 toursmin90 sec

L 3 en12humide

Preacutecipitation

Les colorations

utile en cas de doute lrsquoidentification des

kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces

des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires

coloreacutees

recommandeacutee pour la conservation de

mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre

laboratoire pour avis

indispensable pour le diagnostic de certains

parasites (Cryptosporides microsporides)

Meacutethodes de coloration rapides

(Colorations en tubes)

- Meacutethode de Bailenger et Faraggi

- Meacutethode de Sapro Lawless et

Strome

-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene

tamporeacute

-Meacutethode de Horkin

- Meacutethode de Sargeaut

-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero

Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de

Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-

formol Apregraves meacutelange

- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave

laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout

-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le

fond du tube

-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en

protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees

immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine

des noyaux est coloreacutee en brun par liode

Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent

donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol

sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement

leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes

- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou

directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension

de selles avec le colorant

Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des

protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux

apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs

jours

la coloration de Bailenger

Laisser pendant une nuit en contact

cristal violet 2 g

fuchsine basique 005 g

alcool agrave 95deg 20 ml

pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml

eau distilleacutee 100 ml

Coloration des frottis

Pour bien observer les structures nucleacuteaires et

garder des lames de reacutefeacuterence on

confectionne un frottis de selles humide et

eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en

- 3 temps fixation puis coloration puis

diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)

- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg

Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)

Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag

- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher

soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains

dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)

soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)

soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1

heure)

-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode

-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau

- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3

30 min agrave leacutetuve agrave 37deg

- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece

24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs

-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au

microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent

nettement

-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau

-Deacuteshydrater

-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est

poseacutee deacutefinitivement

- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les

trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure

des noyaux Les kystes apparaissent en bleu

pacircle avec des noyaux bien nets Cest une

technique facile agrave reacutealiser

- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible

- Plonger la lame dans le fixateur colorant de

Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures

- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au

baume de Canada ou au baume syntheacutetique

Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par

Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie

- Seacutechage

- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol

- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid

- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet

- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20

secondes en agitant

- Rinccedilage

-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5

- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100

- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert

Coloration des microscporidies

Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10

- Effectuer un frottis de la selle

- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de

meacutethanol

- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes

- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord

en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml

- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge

Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee

microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-

Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution

- Colorer pendant 3 heures

- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02

-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-

Rincer seacutecher et lire au grossissement x100

Coloration par Uvitex 2B

Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute

pour la chitine Met en eacutevidence les

microsporidie par une fluorescence

directe On obtient une

fluorescence bleue pale sur fond

noir

Scotch test anal ( test de Graham agrave

la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius

vermicularis ainsi que les anneaux ou les

oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors

de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est

appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant

toute toilette en position foetale ou genou

pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus

et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute

sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera

agrave lrsquoobjectif X10

NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les

parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que

la technique devra ecirctre faite avec des gants

ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite

pour eacuteviter la contamination par les oeufs

auto-infestant de lrsquooxyure

Meacutethodes speacuteciales

Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon

eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs

drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle

de la taille drsquoun petit pois

Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen

des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm

dans une quantiteacute de vert malachite agrave

3 (contre colorant) et de glyceacuterine

appliquer la bande sur la selle et sur la

lame renverser et appuyer sur la

paillasse

Methode de Kato-Katz quantitative

utilise un gabarie pour la selle

Meacutethode efficace pour la recherche

doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale

mais inutilisable pour les kytes et les

larves ainsi que les oeufs dankylostome

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

COPROLOGIE PARASITAIRE Conduite de lrsquoexamen

1048766 Examen macroscopique

1048766 Examen microscopique

- Examen direct sans concentration

- Examen direct apreacutes concentration

- Les meacutethodes physiques

- Techniques de flottation

- Techniques de seacutedimentation

- Les meacutethodes physico-chimiques

- Les meacutethodes combineacutees

-Colorations speacutecifiques

- cultures

- Examens particuliers

Lrsquoobservation macroscopique Il permet de noter

- Couleur ( brune jaune ou ocre verte

deacutecoloreacutee noire rouge)

- consistance (molle dure liquide)

- aspect (preacutesence de bulles ou de gras

steacuteatorrheacutee)

- Preacutesence drsquoeacuteleacutements surajouteacutes

-Parasites adulte drsquoAscaris femelle drsquooxuyre

anneau ou chaine de taenia

-glaire (mucus)

-sang de pus

Lrsquoexamen direct sans concentration -Lexamen direct est le seule examen qui permet drsquoappreacutecier la vitaliteacute des

parasites

-Il met en eacutevidence les kystes et les formes veacutegeacutetatives de protozoaires ainsi

quelques oeufs et les larves dhelminthes

- On peut rajouter du Lugol double sur la lame qui fixe et colore les

structure nucleacuteaires

- Quelque soit le reacutesultat de lrsquoexamen direct on doit obligatoirement le

compleacuteter par deux techniques de concentration lrsquoune pour les kystes et

lrsquoautre pour les oeufs

- Il est impeacuteratif de connaitre la deacutescription des eacuteleacutements parasitaire et

de retenir les possibles faux parasites

Lrsquoobservation microscopique

une noisette de selle

(agrave diffeacuterents endroits)

lrsquoeau physiologique

agrave 09

suspension homogegravene

2 gouttes sur une

lame recouvrir par

une lamelle

lecture en

zig-zag x10

x 40

+

Les meacutethodes de concentrations

Les techniques par lesquelles on

essaie agrave partir de la grande quantiteacute

de la matieres feacutecales recueillies

drsquoobtenir dans un faible volume les

œufs larves kystes voire formes

veacutegeacutetatifs fixeacutees de parasites par

eacutelimination des reacutesidus de la

digestion

Les meacutethodes physiques

Les selles dilueacutees dans un reacuteactif de densiteacute

diffeacuterente de celle de parasite

DR superieur DP = flottation

DR inferieur DP = seacutedimentation

A-Techniques de flottation

Crsquoest une technique part du principe que la densiteacute du liquide et supeacuterieur

agrave celle des parasites ces derniers plus leacutegers flottent agrave la surface

Les principales techniques de flottation

- Meacutethode de Fullborn (1920) elle utilise une solution satureacutee de NaCl

(NaCl 250g ED 750ml d=12)

- Meacutethode de Willis (1921) simple et utilisable en routine

bullDiluer une noisette de selle dans la solution satureacutee de NaCl agrave 25

bullRemplissez un tube en verre conique jusquagrave sonbord en formant un

meacutenisque concave (verre de montre) sur lequel on deacutepose une lamelle

pendant 15 minutes (pas plus pour eacuteviter la cristalisation des oeufs) On la

deacutepose ensuite sur une lame porte objet et on observe agrave lrsquoobjectif X10 agrave la

recherche des OEufs drsquohelminthes tels que ceux drsquoHymenolepis ou

drsquoAnkylstomes

-Meacutethode de Janeckso et Urbanyi(1931) utilise comme reacuteactif une

solution de domercurate de potassium ( d=114) qui doit etre manipuleacutee

avec prudence

Iodo-mercurate de potassium

Bi iodure de mercure 100g

Iodure de potassium 74g

Eau distilleacutee 50 ml

-Meacutethode de Faust (1938) on centrifuge agrave 1500 tm une dilution des

selles dans lrsquoeau ordinaire tieacutede et on rejette le surnageant et on remet le

culot en suspension dans drsquoeau On reacutepegravete lrsquoopeacuteration jusqursquoagrave ce que le

surnageant soit limpide on remet alors le culot en suspension dans le

sulfate de Zink agrave 33 Apreacutes centrifugation on preacutelegraveve agrave lrsquoanse de

platine la pellicule de surfase qursquoon examine au microscope

- Meacutethode drsquoOtto Hwitt et Straham (1941) on procegravede de la meme

maniere que pour le Willis mais avec une solution aqueuse de sulfate

de Zink agrave 33 D=118

Avantage -Technique simple

-Mateacuteriel rudimentaire

- reacutealisation en seacuterie

-Sensibiliteacute treacutes bonne++++

Inconveacutenient

-Elle a ce pendant lrsquoinconveacutenient drsquoalteacuterer des Larves et les

Kystes pour les quels elle est contre-indiqueacutee ( reactifs

hypertoniques) de mecircme que pour les selles liquides ou

riches en lipides

-Elle donne de bons reacutesultats pour les oeufs drsquohelminthes

leacutegers (oeufs drsquoHymenolepis drsquoAnkylostome et deTaelignia)

B-Techniques de seacutedimentation bullLe diluant a une densiteacute inferieure agrave celle du

parasite alors se dernier se seacutedimente

Les principales techniques

- Meacutethode par seacutedimentation simple

- Meacutethode de Faust et IngallsReacutealiseacutee en utilisant

lrsquoeau glyceacuterineacutee (Eau + Glyceacuterine agrave 05) elle

permet drsquoaugmenter la mouillabiliteacute qui facilite la

seacutedimentation des parasites larves Anguillules

Œufs drsquoAscaris non feacutecondeacutes et œufs de

Schistosoma mansoni

-Meacutethode de Baroody et MostSeacutedimentation

centrifugation Eau de robinet chauffeacutee agrave 42degC

- Meacutethode de Jahnes et Hodges

Avantage -Technique simple

-Mateacuteriel rudimentaire

- reacutealisation en seacuterie

- Traitent une grande masse feacutecale ( parasites rares ou irreacuteguliegraverere ment

repartis dans la selle)

Inconveacutenient -une technique longue agrave reacutealiser

-Les cellules veacutegeacutetales seacutedimentent aussi vite que les parasites (Preacutesence

de certains reacutesidus)

-Non indiqueacutes en routine (sensibiliteacute

moyenne++)

Meacutethodes physico-chimiques ou

Diphasiques Caracteacuteriseacutees par la mise en preacutesence de deux

phases non miscibles lrsquoune aqueuse et lrsquoautre

constitueacutee par lrsquoeacutether qui est un solvant des lipidesil

se creacutee un coefficient de partage entre ces deux

phases et la reacutepartition de chaque eacuteleacutement feacutecal dans

chacune drsquoelles sera isoleacutes en fonction de son pouvoir

hydrophile ou lipophile

Bailenger a montreacute que le pH de la solution eacutetait

leacuteleacutement deacuteterminant pour la plus ou moins grande

efficaciteacute dune technique selon le parasite rechercheacute

Principes theacuteoriques

-Les selles tritureacutees (meacutelange au dixiegraveme environ) dans la solution choisie - elle peut ecirctre preacutealablement passeacutee sur un tamis pour eacuteliminer les gros deacutebris

le filtrat est verseacute dans un tube agrave centrifuger agrave fond conique en le remplissant 13

deacutether de maniegravere agrave ce quil y ai 23 du meacutelange selle en laissant 1 cm pour

fermer le tube

- Lrsquoagiter pendant une minute

- La suspension eacutetheacutero-liquide obtenue est centrifugeacutee agrave une vitesse lente de

lordre de 1500 agrave 2000 toursminute pendant une agrave trois minutes

- Apregraves centrifugation les constituants de la suspension sont reacutepartis en quatre

Couches

- Deacutecoller la couche des reacutesidus lipophiles agrave laide dune baguette de verre

- Retourner le tube au dessus de leacutevier (en faisant couler de leau) ou dun bac agrave

deacutechets liquides

- Essuyer les parois du tube avec un coton tenu agrave la pince en laissant toujours le

tube avec louverture dirigeacutee vers le bas pour eacuteviter de souiller le culot avec les

reacutesidus

- Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique pour

remettre en suspension le culot qui sera examineacute

- le culot qui nous inteacuteresse qui contient les eacuteleacutement parasitaires (kystes des

protozoaires)

Ether Debris

Phase aqueuse

Le culot

Les meacutethodes diphasiques sont

-Meacutethode de Telmann 1908

-Meacutethode De Rivas 1928

-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917

-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946

-Meacutethode De Ritchie 1948

-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood

-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf

-Meacutethode De Roman 1957

-Meacutethode de Bailenger 1962-1963

-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle

-Meacutethode de Junod 1927

Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage

Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia

Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)

La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble

lors de la centrifugation ce qui est un argument

diagnostique inteacuteressant

- Inconveacutenients

Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve

restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave

deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses

- Deacuteroulement de la technique

acide aceacutetique cristallisable 5 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethode de Bailenger - Avantages

Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et

des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5

(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)

- Inconveacutenients

Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre

technique est neacutecessaire

- Deacuteroulement de la technique

aceacutetate de sodium 15 g

acide aceacutetique 36 ml

eau distilleacutee qsp 1000 ml

Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide

dun pH-megravetre

Meacutethode de Ritchie simplifieacutee

- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles

formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour

enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les

oeufs dascaris et de schistosome

- Inconveacutenients

Le culot souvent volumineux est de lecture difficile

- Deacuteroulement de la technique

- Solutions de Ritchie

eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt

eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)

Meacutethode de Blagg et al

-Avantages

-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire

les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de

liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de

mercure souille les effluents du laboratoire

- Deacuteroulement de la technique

Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou

additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est

verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation

eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes

Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)

permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute

Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et

recommencer lagitation

On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et

cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee

Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages

-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles

Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes

aiseacutement et facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de

schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue

que les techniques en un temps

- Deacuteroulement de la technique

A) NaCl 9 g

formol officinal 10 ml

eau qsp 1000 ml

B) acide citrique 100 g

formol officinal 20 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethodes combineacutees

Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et

par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande

quantiteacute de selles

Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les

rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des

formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale

- Inconveacutenients

Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez

mal - Deacuteroulement de la technique

A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml

formol officinal 100 ml

eau qsp 1 000 ml

B bromure de sodium cristalliseacute 622 g

eau distilleacutee 1000 ml

Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant

pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou

kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour

trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente

- Inconveacutenients

Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps

assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate

preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)

- Deacuteroulement de la technique

- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)

liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml

eau distilleacutee 334 ml

Concentration diphasique

(MIF ou Bailenger)

une solution de

sulfate de zinc

30 secondes agrave f v

dilueacute au quart avec ED

Examiner

Le culot

Examiner

Le culot

iodomercurate

de potassium

de densiteacute 15

dilueacute au quart avec ED

Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod

simplifieacutee) - Avantages

donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete

- Inconveacutenients

Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi

dune solution de iodomercurate

- Deacuteroulement de la technique

Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)

- aceacutetate de sodium 15 g

- acide aceacutetique cristallisable 20 ml

- formol 40 ml

-eau qsp 1000 ml

Solution B (densiteacute 140)

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 442 volumes

8 g de selles

50 ml de solution de NaCl agrave

85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min

Suspension homo

+Tamisage Examiner

Le culot

eacuteliminer

le surnageant

20 ml dune solution A

+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique

1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min

4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer

le surnageant

Examiner

Le culot

Meacutethode de seacutedimentation-flottation

pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves

- Inconveacutenients

Quand la teneur des selles en lipides est anormalement

eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de

graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique

Solution de densiteacute 135

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 520 volumes

la suspension feacutecale en

eau agrave 85 de NaCl

1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min

1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min

20 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacute

eacuteliminer

le surnageant

5 agrave 7 ml de solution diodomercurate

de potassium de densiteacute 135 20 ml deau

Examen du culot

Seacutedimentation-flottation au saccharose

pour protozoaires - Avantages

permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les

kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand

lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste

na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des

selles fixeacutees au MIF

- Inconveacutenients

Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et

flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De

plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre

que des sels de mercure sont encore utiliseacutes

-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose

saccharose 120 g

eau 200 ml

Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et

utiliser alors

saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml

Suspension homo

+Tamisage +

2 agrave 3 heures

50 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacutee

fraicircche

10 agrave 15 ml de la suspension

1800-2000 toursmin 90sec

rejeter le surnageant

L 1 en12humide

3 agrave 4 g de selles

Seacute

dim

en

tatio

n

8 agrave 10 ml de solution de saccharose

+ 05 ml de solution de chlorure

mercurique agrave 15 en ED

1000 toursmin 45 sec

deacutecanter le

surnageant

dans T2

L 2 en12humide

Flottation

T2 20 agrave 30 ml deau

2000 toursmin90 sec

L 3 en12humide

Preacutecipitation

Les colorations

utile en cas de doute lrsquoidentification des

kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces

des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires

coloreacutees

recommandeacutee pour la conservation de

mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre

laboratoire pour avis

indispensable pour le diagnostic de certains

parasites (Cryptosporides microsporides)

Meacutethodes de coloration rapides

(Colorations en tubes)

- Meacutethode de Bailenger et Faraggi

- Meacutethode de Sapro Lawless et

Strome

-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene

tamporeacute

-Meacutethode de Horkin

- Meacutethode de Sargeaut

-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero

Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de

Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-

formol Apregraves meacutelange

- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave

laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout

-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le

fond du tube

-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en

protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees

immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine

des noyaux est coloreacutee en brun par liode

Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent

donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol

sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement

leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes

- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou

directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension

de selles avec le colorant

Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des

protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux

apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs

jours

la coloration de Bailenger

Laisser pendant une nuit en contact

cristal violet 2 g

fuchsine basique 005 g

alcool agrave 95deg 20 ml

pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml

eau distilleacutee 100 ml

Coloration des frottis

Pour bien observer les structures nucleacuteaires et

garder des lames de reacutefeacuterence on

confectionne un frottis de selles humide et

eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en

- 3 temps fixation puis coloration puis

diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)

- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg

Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)

Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag

- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher

soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains

dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)

soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)

soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1

heure)

-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode

-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau

- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3

30 min agrave leacutetuve agrave 37deg

- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece

24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs

-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au

microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent

nettement

-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau

-Deacuteshydrater

-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est

poseacutee deacutefinitivement

- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les

trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure

des noyaux Les kystes apparaissent en bleu

pacircle avec des noyaux bien nets Cest une

technique facile agrave reacutealiser

- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible

- Plonger la lame dans le fixateur colorant de

Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures

- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au

baume de Canada ou au baume syntheacutetique

Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par

Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie

- Seacutechage

- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol

- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid

- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet

- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20

secondes en agitant

- Rinccedilage

-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5

- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100

- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert

Coloration des microscporidies

Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10

- Effectuer un frottis de la selle

- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de

meacutethanol

- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes

- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord

en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml

- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge

Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee

microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-

Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution

- Colorer pendant 3 heures

- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02

-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-

Rincer seacutecher et lire au grossissement x100

Coloration par Uvitex 2B

Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute

pour la chitine Met en eacutevidence les

microsporidie par une fluorescence

directe On obtient une

fluorescence bleue pale sur fond

noir

Scotch test anal ( test de Graham agrave

la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius

vermicularis ainsi que les anneaux ou les

oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors

de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est

appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant

toute toilette en position foetale ou genou

pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus

et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute

sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera

agrave lrsquoobjectif X10

NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les

parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que

la technique devra ecirctre faite avec des gants

ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite

pour eacuteviter la contamination par les oeufs

auto-infestant de lrsquooxyure

Meacutethodes speacuteciales

Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon

eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs

drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle

de la taille drsquoun petit pois

Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen

des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm

dans une quantiteacute de vert malachite agrave

3 (contre colorant) et de glyceacuterine

appliquer la bande sur la selle et sur la

lame renverser et appuyer sur la

paillasse

Methode de Kato-Katz quantitative

utilise un gabarie pour la selle

Meacutethode efficace pour la recherche

doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale

mais inutilisable pour les kytes et les

larves ainsi que les oeufs dankylostome

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

Lrsquoobservation macroscopique Il permet de noter

- Couleur ( brune jaune ou ocre verte

deacutecoloreacutee noire rouge)

- consistance (molle dure liquide)

- aspect (preacutesence de bulles ou de gras

steacuteatorrheacutee)

- Preacutesence drsquoeacuteleacutements surajouteacutes

-Parasites adulte drsquoAscaris femelle drsquooxuyre

anneau ou chaine de taenia

-glaire (mucus)

-sang de pus

Lrsquoexamen direct sans concentration -Lexamen direct est le seule examen qui permet drsquoappreacutecier la vitaliteacute des

parasites

-Il met en eacutevidence les kystes et les formes veacutegeacutetatives de protozoaires ainsi

quelques oeufs et les larves dhelminthes

- On peut rajouter du Lugol double sur la lame qui fixe et colore les

structure nucleacuteaires

- Quelque soit le reacutesultat de lrsquoexamen direct on doit obligatoirement le

compleacuteter par deux techniques de concentration lrsquoune pour les kystes et

lrsquoautre pour les oeufs

- Il est impeacuteratif de connaitre la deacutescription des eacuteleacutements parasitaire et

de retenir les possibles faux parasites

Lrsquoobservation microscopique

une noisette de selle

(agrave diffeacuterents endroits)

lrsquoeau physiologique

agrave 09

suspension homogegravene

2 gouttes sur une

lame recouvrir par

une lamelle

lecture en

zig-zag x10

x 40

+

Les meacutethodes de concentrations

Les techniques par lesquelles on

essaie agrave partir de la grande quantiteacute

de la matieres feacutecales recueillies

drsquoobtenir dans un faible volume les

œufs larves kystes voire formes

veacutegeacutetatifs fixeacutees de parasites par

eacutelimination des reacutesidus de la

digestion

Les meacutethodes physiques

Les selles dilueacutees dans un reacuteactif de densiteacute

diffeacuterente de celle de parasite

DR superieur DP = flottation

DR inferieur DP = seacutedimentation

A-Techniques de flottation

Crsquoest une technique part du principe que la densiteacute du liquide et supeacuterieur

agrave celle des parasites ces derniers plus leacutegers flottent agrave la surface

Les principales techniques de flottation

- Meacutethode de Fullborn (1920) elle utilise une solution satureacutee de NaCl

(NaCl 250g ED 750ml d=12)

- Meacutethode de Willis (1921) simple et utilisable en routine

bullDiluer une noisette de selle dans la solution satureacutee de NaCl agrave 25

bullRemplissez un tube en verre conique jusquagrave sonbord en formant un

meacutenisque concave (verre de montre) sur lequel on deacutepose une lamelle

pendant 15 minutes (pas plus pour eacuteviter la cristalisation des oeufs) On la

deacutepose ensuite sur une lame porte objet et on observe agrave lrsquoobjectif X10 agrave la

recherche des OEufs drsquohelminthes tels que ceux drsquoHymenolepis ou

drsquoAnkylstomes

-Meacutethode de Janeckso et Urbanyi(1931) utilise comme reacuteactif une

solution de domercurate de potassium ( d=114) qui doit etre manipuleacutee

avec prudence

Iodo-mercurate de potassium

Bi iodure de mercure 100g

Iodure de potassium 74g

Eau distilleacutee 50 ml

-Meacutethode de Faust (1938) on centrifuge agrave 1500 tm une dilution des

selles dans lrsquoeau ordinaire tieacutede et on rejette le surnageant et on remet le

culot en suspension dans drsquoeau On reacutepegravete lrsquoopeacuteration jusqursquoagrave ce que le

surnageant soit limpide on remet alors le culot en suspension dans le

sulfate de Zink agrave 33 Apreacutes centrifugation on preacutelegraveve agrave lrsquoanse de

platine la pellicule de surfase qursquoon examine au microscope

- Meacutethode drsquoOtto Hwitt et Straham (1941) on procegravede de la meme

maniere que pour le Willis mais avec une solution aqueuse de sulfate

de Zink agrave 33 D=118

Avantage -Technique simple

-Mateacuteriel rudimentaire

- reacutealisation en seacuterie

-Sensibiliteacute treacutes bonne++++

Inconveacutenient

-Elle a ce pendant lrsquoinconveacutenient drsquoalteacuterer des Larves et les

Kystes pour les quels elle est contre-indiqueacutee ( reactifs

hypertoniques) de mecircme que pour les selles liquides ou

riches en lipides

-Elle donne de bons reacutesultats pour les oeufs drsquohelminthes

leacutegers (oeufs drsquoHymenolepis drsquoAnkylostome et deTaelignia)

B-Techniques de seacutedimentation bullLe diluant a une densiteacute inferieure agrave celle du

parasite alors se dernier se seacutedimente

Les principales techniques

- Meacutethode par seacutedimentation simple

- Meacutethode de Faust et IngallsReacutealiseacutee en utilisant

lrsquoeau glyceacuterineacutee (Eau + Glyceacuterine agrave 05) elle

permet drsquoaugmenter la mouillabiliteacute qui facilite la

seacutedimentation des parasites larves Anguillules

Œufs drsquoAscaris non feacutecondeacutes et œufs de

Schistosoma mansoni

-Meacutethode de Baroody et MostSeacutedimentation

centrifugation Eau de robinet chauffeacutee agrave 42degC

- Meacutethode de Jahnes et Hodges

Avantage -Technique simple

-Mateacuteriel rudimentaire

- reacutealisation en seacuterie

- Traitent une grande masse feacutecale ( parasites rares ou irreacuteguliegraverere ment

repartis dans la selle)

Inconveacutenient -une technique longue agrave reacutealiser

-Les cellules veacutegeacutetales seacutedimentent aussi vite que les parasites (Preacutesence

de certains reacutesidus)

-Non indiqueacutes en routine (sensibiliteacute

moyenne++)

Meacutethodes physico-chimiques ou

Diphasiques Caracteacuteriseacutees par la mise en preacutesence de deux

phases non miscibles lrsquoune aqueuse et lrsquoautre

constitueacutee par lrsquoeacutether qui est un solvant des lipidesil

se creacutee un coefficient de partage entre ces deux

phases et la reacutepartition de chaque eacuteleacutement feacutecal dans

chacune drsquoelles sera isoleacutes en fonction de son pouvoir

hydrophile ou lipophile

Bailenger a montreacute que le pH de la solution eacutetait

leacuteleacutement deacuteterminant pour la plus ou moins grande

efficaciteacute dune technique selon le parasite rechercheacute

Principes theacuteoriques

-Les selles tritureacutees (meacutelange au dixiegraveme environ) dans la solution choisie - elle peut ecirctre preacutealablement passeacutee sur un tamis pour eacuteliminer les gros deacutebris

le filtrat est verseacute dans un tube agrave centrifuger agrave fond conique en le remplissant 13

deacutether de maniegravere agrave ce quil y ai 23 du meacutelange selle en laissant 1 cm pour

fermer le tube

- Lrsquoagiter pendant une minute

- La suspension eacutetheacutero-liquide obtenue est centrifugeacutee agrave une vitesse lente de

lordre de 1500 agrave 2000 toursminute pendant une agrave trois minutes

- Apregraves centrifugation les constituants de la suspension sont reacutepartis en quatre

Couches

- Deacutecoller la couche des reacutesidus lipophiles agrave laide dune baguette de verre

- Retourner le tube au dessus de leacutevier (en faisant couler de leau) ou dun bac agrave

deacutechets liquides

- Essuyer les parois du tube avec un coton tenu agrave la pince en laissant toujours le

tube avec louverture dirigeacutee vers le bas pour eacuteviter de souiller le culot avec les

reacutesidus

- Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique pour

remettre en suspension le culot qui sera examineacute

- le culot qui nous inteacuteresse qui contient les eacuteleacutement parasitaires (kystes des

protozoaires)

Ether Debris

Phase aqueuse

Le culot

Les meacutethodes diphasiques sont

-Meacutethode de Telmann 1908

-Meacutethode De Rivas 1928

-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917

-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946

-Meacutethode De Ritchie 1948

-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood

-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf

-Meacutethode De Roman 1957

-Meacutethode de Bailenger 1962-1963

-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle

-Meacutethode de Junod 1927

Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage

Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia

Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)

La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble

lors de la centrifugation ce qui est un argument

diagnostique inteacuteressant

- Inconveacutenients

Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve

restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave

deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses

- Deacuteroulement de la technique

acide aceacutetique cristallisable 5 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethode de Bailenger - Avantages

Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et

des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5

(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)

- Inconveacutenients

Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre

technique est neacutecessaire

- Deacuteroulement de la technique

aceacutetate de sodium 15 g

acide aceacutetique 36 ml

eau distilleacutee qsp 1000 ml

Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide

dun pH-megravetre

Meacutethode de Ritchie simplifieacutee

- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles

formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour

enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les

oeufs dascaris et de schistosome

- Inconveacutenients

Le culot souvent volumineux est de lecture difficile

- Deacuteroulement de la technique

- Solutions de Ritchie

eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt

eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)

Meacutethode de Blagg et al

-Avantages

-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire

les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de

liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de

mercure souille les effluents du laboratoire

- Deacuteroulement de la technique

Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou

additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est

verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation

eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes

Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)

permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute

Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et

recommencer lagitation

On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et

cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee

Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages

-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles

Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes

aiseacutement et facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de

schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue

que les techniques en un temps

- Deacuteroulement de la technique

A) NaCl 9 g

formol officinal 10 ml

eau qsp 1000 ml

B) acide citrique 100 g

formol officinal 20 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethodes combineacutees

Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et

par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande

quantiteacute de selles

Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les

rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des

formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale

- Inconveacutenients

Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez

mal - Deacuteroulement de la technique

A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml

formol officinal 100 ml

eau qsp 1 000 ml

B bromure de sodium cristalliseacute 622 g

eau distilleacutee 1000 ml

Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant

pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou

kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour

trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente

- Inconveacutenients

Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps

assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate

preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)

- Deacuteroulement de la technique

- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)

liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml

eau distilleacutee 334 ml

Concentration diphasique

(MIF ou Bailenger)

une solution de

sulfate de zinc

30 secondes agrave f v

dilueacute au quart avec ED

Examiner

Le culot

Examiner

Le culot

iodomercurate

de potassium

de densiteacute 15

dilueacute au quart avec ED

Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod

simplifieacutee) - Avantages

donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete

- Inconveacutenients

Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi

dune solution de iodomercurate

- Deacuteroulement de la technique

Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)

- aceacutetate de sodium 15 g

- acide aceacutetique cristallisable 20 ml

- formol 40 ml

-eau qsp 1000 ml

Solution B (densiteacute 140)

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 442 volumes

8 g de selles

50 ml de solution de NaCl agrave

85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min

Suspension homo

+Tamisage Examiner

Le culot

eacuteliminer

le surnageant

20 ml dune solution A

+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique

1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min

4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer

le surnageant

Examiner

Le culot

Meacutethode de seacutedimentation-flottation

pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves

- Inconveacutenients

Quand la teneur des selles en lipides est anormalement

eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de

graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique

Solution de densiteacute 135

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 520 volumes

la suspension feacutecale en

eau agrave 85 de NaCl

1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min

1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min

20 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacute

eacuteliminer

le surnageant

5 agrave 7 ml de solution diodomercurate

de potassium de densiteacute 135 20 ml deau

Examen du culot

Seacutedimentation-flottation au saccharose

pour protozoaires - Avantages

permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les

kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand

lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste

na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des

selles fixeacutees au MIF

- Inconveacutenients

Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et

flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De

plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre

que des sels de mercure sont encore utiliseacutes

-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose

saccharose 120 g

eau 200 ml

Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et

utiliser alors

saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml

Suspension homo

+Tamisage +

2 agrave 3 heures

50 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacutee

fraicircche

10 agrave 15 ml de la suspension

1800-2000 toursmin 90sec

rejeter le surnageant

L 1 en12humide

3 agrave 4 g de selles

Seacute

dim

en

tatio

n

8 agrave 10 ml de solution de saccharose

+ 05 ml de solution de chlorure

mercurique agrave 15 en ED

1000 toursmin 45 sec

deacutecanter le

surnageant

dans T2

L 2 en12humide

Flottation

T2 20 agrave 30 ml deau

2000 toursmin90 sec

L 3 en12humide

Preacutecipitation

Les colorations

utile en cas de doute lrsquoidentification des

kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces

des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires

coloreacutees

recommandeacutee pour la conservation de

mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre

laboratoire pour avis

indispensable pour le diagnostic de certains

parasites (Cryptosporides microsporides)

Meacutethodes de coloration rapides

(Colorations en tubes)

- Meacutethode de Bailenger et Faraggi

- Meacutethode de Sapro Lawless et

Strome

-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene

tamporeacute

-Meacutethode de Horkin

- Meacutethode de Sargeaut

-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero

Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de

Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-

formol Apregraves meacutelange

- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave

laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout

-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le

fond du tube

-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en

protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees

immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine

des noyaux est coloreacutee en brun par liode

Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent

donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol

sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement

leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes

- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou

directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension

de selles avec le colorant

Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des

protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux

apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs

jours

la coloration de Bailenger

Laisser pendant une nuit en contact

cristal violet 2 g

fuchsine basique 005 g

alcool agrave 95deg 20 ml

pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml

eau distilleacutee 100 ml

Coloration des frottis

Pour bien observer les structures nucleacuteaires et

garder des lames de reacutefeacuterence on

confectionne un frottis de selles humide et

eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en

- 3 temps fixation puis coloration puis

diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)

- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg

Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)

Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag

- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher

soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains

dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)

soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)

soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1

heure)

-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode

-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau

- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3

30 min agrave leacutetuve agrave 37deg

- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece

24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs

-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au

microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent

nettement

-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau

-Deacuteshydrater

-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est

poseacutee deacutefinitivement

- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les

trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure

des noyaux Les kystes apparaissent en bleu

pacircle avec des noyaux bien nets Cest une

technique facile agrave reacutealiser

- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible

- Plonger la lame dans le fixateur colorant de

Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures

- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au

baume de Canada ou au baume syntheacutetique

Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par

Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie

- Seacutechage

- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol

- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid

- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet

- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20

secondes en agitant

- Rinccedilage

-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5

- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100

- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert

Coloration des microscporidies

Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10

- Effectuer un frottis de la selle

- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de

meacutethanol

- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes

- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord

en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml

- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge

Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee

microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-

Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution

- Colorer pendant 3 heures

- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02

-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-

Rincer seacutecher et lire au grossissement x100

Coloration par Uvitex 2B

Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute

pour la chitine Met en eacutevidence les

microsporidie par une fluorescence

directe On obtient une

fluorescence bleue pale sur fond

noir

Scotch test anal ( test de Graham agrave

la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius

vermicularis ainsi que les anneaux ou les

oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors

de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est

appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant

toute toilette en position foetale ou genou

pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus

et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute

sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera

agrave lrsquoobjectif X10

NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les

parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que

la technique devra ecirctre faite avec des gants

ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite

pour eacuteviter la contamination par les oeufs

auto-infestant de lrsquooxyure

Meacutethodes speacuteciales

Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon

eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs

drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle

de la taille drsquoun petit pois

Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen

des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm

dans une quantiteacute de vert malachite agrave

3 (contre colorant) et de glyceacuterine

appliquer la bande sur la selle et sur la

lame renverser et appuyer sur la

paillasse

Methode de Kato-Katz quantitative

utilise un gabarie pour la selle

Meacutethode efficace pour la recherche

doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale

mais inutilisable pour les kytes et les

larves ainsi que les oeufs dankylostome

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

Lrsquoexamen direct sans concentration -Lexamen direct est le seule examen qui permet drsquoappreacutecier la vitaliteacute des

parasites

-Il met en eacutevidence les kystes et les formes veacutegeacutetatives de protozoaires ainsi

quelques oeufs et les larves dhelminthes

- On peut rajouter du Lugol double sur la lame qui fixe et colore les

structure nucleacuteaires

- Quelque soit le reacutesultat de lrsquoexamen direct on doit obligatoirement le

compleacuteter par deux techniques de concentration lrsquoune pour les kystes et

lrsquoautre pour les oeufs

- Il est impeacuteratif de connaitre la deacutescription des eacuteleacutements parasitaire et

de retenir les possibles faux parasites

Lrsquoobservation microscopique

une noisette de selle

(agrave diffeacuterents endroits)

lrsquoeau physiologique

agrave 09

suspension homogegravene

2 gouttes sur une

lame recouvrir par

une lamelle

lecture en

zig-zag x10

x 40

+

Les meacutethodes de concentrations

Les techniques par lesquelles on

essaie agrave partir de la grande quantiteacute

de la matieres feacutecales recueillies

drsquoobtenir dans un faible volume les

œufs larves kystes voire formes

veacutegeacutetatifs fixeacutees de parasites par

eacutelimination des reacutesidus de la

digestion

Les meacutethodes physiques

Les selles dilueacutees dans un reacuteactif de densiteacute

diffeacuterente de celle de parasite

DR superieur DP = flottation

DR inferieur DP = seacutedimentation

A-Techniques de flottation

Crsquoest une technique part du principe que la densiteacute du liquide et supeacuterieur

agrave celle des parasites ces derniers plus leacutegers flottent agrave la surface

Les principales techniques de flottation

- Meacutethode de Fullborn (1920) elle utilise une solution satureacutee de NaCl

(NaCl 250g ED 750ml d=12)

- Meacutethode de Willis (1921) simple et utilisable en routine

bullDiluer une noisette de selle dans la solution satureacutee de NaCl agrave 25

bullRemplissez un tube en verre conique jusquagrave sonbord en formant un

meacutenisque concave (verre de montre) sur lequel on deacutepose une lamelle

pendant 15 minutes (pas plus pour eacuteviter la cristalisation des oeufs) On la

deacutepose ensuite sur une lame porte objet et on observe agrave lrsquoobjectif X10 agrave la

recherche des OEufs drsquohelminthes tels que ceux drsquoHymenolepis ou

drsquoAnkylstomes

-Meacutethode de Janeckso et Urbanyi(1931) utilise comme reacuteactif une

solution de domercurate de potassium ( d=114) qui doit etre manipuleacutee

avec prudence

Iodo-mercurate de potassium

Bi iodure de mercure 100g

Iodure de potassium 74g

Eau distilleacutee 50 ml

-Meacutethode de Faust (1938) on centrifuge agrave 1500 tm une dilution des

selles dans lrsquoeau ordinaire tieacutede et on rejette le surnageant et on remet le

culot en suspension dans drsquoeau On reacutepegravete lrsquoopeacuteration jusqursquoagrave ce que le

surnageant soit limpide on remet alors le culot en suspension dans le

sulfate de Zink agrave 33 Apreacutes centrifugation on preacutelegraveve agrave lrsquoanse de

platine la pellicule de surfase qursquoon examine au microscope

- Meacutethode drsquoOtto Hwitt et Straham (1941) on procegravede de la meme

maniere que pour le Willis mais avec une solution aqueuse de sulfate

de Zink agrave 33 D=118

Avantage -Technique simple

-Mateacuteriel rudimentaire

- reacutealisation en seacuterie

-Sensibiliteacute treacutes bonne++++

Inconveacutenient

-Elle a ce pendant lrsquoinconveacutenient drsquoalteacuterer des Larves et les

Kystes pour les quels elle est contre-indiqueacutee ( reactifs

hypertoniques) de mecircme que pour les selles liquides ou

riches en lipides

-Elle donne de bons reacutesultats pour les oeufs drsquohelminthes

leacutegers (oeufs drsquoHymenolepis drsquoAnkylostome et deTaelignia)

B-Techniques de seacutedimentation bullLe diluant a une densiteacute inferieure agrave celle du

parasite alors se dernier se seacutedimente

Les principales techniques

- Meacutethode par seacutedimentation simple

- Meacutethode de Faust et IngallsReacutealiseacutee en utilisant

lrsquoeau glyceacuterineacutee (Eau + Glyceacuterine agrave 05) elle

permet drsquoaugmenter la mouillabiliteacute qui facilite la

seacutedimentation des parasites larves Anguillules

Œufs drsquoAscaris non feacutecondeacutes et œufs de

Schistosoma mansoni

-Meacutethode de Baroody et MostSeacutedimentation

centrifugation Eau de robinet chauffeacutee agrave 42degC

- Meacutethode de Jahnes et Hodges

Avantage -Technique simple

-Mateacuteriel rudimentaire

- reacutealisation en seacuterie

- Traitent une grande masse feacutecale ( parasites rares ou irreacuteguliegraverere ment

repartis dans la selle)

Inconveacutenient -une technique longue agrave reacutealiser

-Les cellules veacutegeacutetales seacutedimentent aussi vite que les parasites (Preacutesence

de certains reacutesidus)

-Non indiqueacutes en routine (sensibiliteacute

moyenne++)

Meacutethodes physico-chimiques ou

Diphasiques Caracteacuteriseacutees par la mise en preacutesence de deux

phases non miscibles lrsquoune aqueuse et lrsquoautre

constitueacutee par lrsquoeacutether qui est un solvant des lipidesil

se creacutee un coefficient de partage entre ces deux

phases et la reacutepartition de chaque eacuteleacutement feacutecal dans

chacune drsquoelles sera isoleacutes en fonction de son pouvoir

hydrophile ou lipophile

Bailenger a montreacute que le pH de la solution eacutetait

leacuteleacutement deacuteterminant pour la plus ou moins grande

efficaciteacute dune technique selon le parasite rechercheacute

Principes theacuteoriques

-Les selles tritureacutees (meacutelange au dixiegraveme environ) dans la solution choisie - elle peut ecirctre preacutealablement passeacutee sur un tamis pour eacuteliminer les gros deacutebris

le filtrat est verseacute dans un tube agrave centrifuger agrave fond conique en le remplissant 13

deacutether de maniegravere agrave ce quil y ai 23 du meacutelange selle en laissant 1 cm pour

fermer le tube

- Lrsquoagiter pendant une minute

- La suspension eacutetheacutero-liquide obtenue est centrifugeacutee agrave une vitesse lente de

lordre de 1500 agrave 2000 toursminute pendant une agrave trois minutes

- Apregraves centrifugation les constituants de la suspension sont reacutepartis en quatre

Couches

- Deacutecoller la couche des reacutesidus lipophiles agrave laide dune baguette de verre

- Retourner le tube au dessus de leacutevier (en faisant couler de leau) ou dun bac agrave

deacutechets liquides

- Essuyer les parois du tube avec un coton tenu agrave la pince en laissant toujours le

tube avec louverture dirigeacutee vers le bas pour eacuteviter de souiller le culot avec les

reacutesidus

- Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique pour

remettre en suspension le culot qui sera examineacute

- le culot qui nous inteacuteresse qui contient les eacuteleacutement parasitaires (kystes des

protozoaires)

Ether Debris

Phase aqueuse

Le culot

Les meacutethodes diphasiques sont

-Meacutethode de Telmann 1908

-Meacutethode De Rivas 1928

-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917

-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946

-Meacutethode De Ritchie 1948

-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood

-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf

-Meacutethode De Roman 1957

-Meacutethode de Bailenger 1962-1963

-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle

-Meacutethode de Junod 1927

Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage

Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia

Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)

La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble

lors de la centrifugation ce qui est un argument

diagnostique inteacuteressant

- Inconveacutenients

Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve

restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave

deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses

- Deacuteroulement de la technique

acide aceacutetique cristallisable 5 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethode de Bailenger - Avantages

Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et

des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5

(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)

- Inconveacutenients

Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre

technique est neacutecessaire

- Deacuteroulement de la technique

aceacutetate de sodium 15 g

acide aceacutetique 36 ml

eau distilleacutee qsp 1000 ml

Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide

dun pH-megravetre

Meacutethode de Ritchie simplifieacutee

- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles

formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour

enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les

oeufs dascaris et de schistosome

- Inconveacutenients

Le culot souvent volumineux est de lecture difficile

- Deacuteroulement de la technique

- Solutions de Ritchie

eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt

eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)

Meacutethode de Blagg et al

-Avantages

-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire

les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de

liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de

mercure souille les effluents du laboratoire

- Deacuteroulement de la technique

Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou

additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est

verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation

eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes

Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)

permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute

Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et

recommencer lagitation

On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et

cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee

Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages

-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles

Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes

aiseacutement et facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de

schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue

que les techniques en un temps

- Deacuteroulement de la technique

A) NaCl 9 g

formol officinal 10 ml

eau qsp 1000 ml

B) acide citrique 100 g

formol officinal 20 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethodes combineacutees

Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et

par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande

quantiteacute de selles

Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les

rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des

formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale

- Inconveacutenients

Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez

mal - Deacuteroulement de la technique

A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml

formol officinal 100 ml

eau qsp 1 000 ml

B bromure de sodium cristalliseacute 622 g

eau distilleacutee 1000 ml

Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant

pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou

kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour

trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente

- Inconveacutenients

Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps

assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate

preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)

- Deacuteroulement de la technique

- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)

liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml

eau distilleacutee 334 ml

Concentration diphasique

(MIF ou Bailenger)

une solution de

sulfate de zinc

30 secondes agrave f v

dilueacute au quart avec ED

Examiner

Le culot

Examiner

Le culot

iodomercurate

de potassium

de densiteacute 15

dilueacute au quart avec ED

Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod

simplifieacutee) - Avantages

donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete

- Inconveacutenients

Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi

dune solution de iodomercurate

- Deacuteroulement de la technique

Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)

- aceacutetate de sodium 15 g

- acide aceacutetique cristallisable 20 ml

- formol 40 ml

-eau qsp 1000 ml

Solution B (densiteacute 140)

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 442 volumes

8 g de selles

50 ml de solution de NaCl agrave

85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min

Suspension homo

+Tamisage Examiner

Le culot

eacuteliminer

le surnageant

20 ml dune solution A

+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique

1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min

4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer

le surnageant

Examiner

Le culot

Meacutethode de seacutedimentation-flottation

pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves

- Inconveacutenients

Quand la teneur des selles en lipides est anormalement

eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de

graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique

Solution de densiteacute 135

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 520 volumes

la suspension feacutecale en

eau agrave 85 de NaCl

1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min

1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min

20 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacute

eacuteliminer

le surnageant

5 agrave 7 ml de solution diodomercurate

de potassium de densiteacute 135 20 ml deau

Examen du culot

Seacutedimentation-flottation au saccharose

pour protozoaires - Avantages

permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les

kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand

lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste

na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des

selles fixeacutees au MIF

- Inconveacutenients

Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et

flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De

plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre

que des sels de mercure sont encore utiliseacutes

-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose

saccharose 120 g

eau 200 ml

Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et

utiliser alors

saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml

Suspension homo

+Tamisage +

2 agrave 3 heures

50 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacutee

fraicircche

10 agrave 15 ml de la suspension

1800-2000 toursmin 90sec

rejeter le surnageant

L 1 en12humide

3 agrave 4 g de selles

Seacute

dim

en

tatio

n

8 agrave 10 ml de solution de saccharose

+ 05 ml de solution de chlorure

mercurique agrave 15 en ED

1000 toursmin 45 sec

deacutecanter le

surnageant

dans T2

L 2 en12humide

Flottation

T2 20 agrave 30 ml deau

2000 toursmin90 sec

L 3 en12humide

Preacutecipitation

Les colorations

utile en cas de doute lrsquoidentification des

kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces

des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires

coloreacutees

recommandeacutee pour la conservation de

mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre

laboratoire pour avis

indispensable pour le diagnostic de certains

parasites (Cryptosporides microsporides)

Meacutethodes de coloration rapides

(Colorations en tubes)

- Meacutethode de Bailenger et Faraggi

- Meacutethode de Sapro Lawless et

Strome

-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene

tamporeacute

-Meacutethode de Horkin

- Meacutethode de Sargeaut

-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero

Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de

Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-

formol Apregraves meacutelange

- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave

laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout

-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le

fond du tube

-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en

protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees

immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine

des noyaux est coloreacutee en brun par liode

Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent

donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol

sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement

leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes

- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou

directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension

de selles avec le colorant

Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des

protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux

apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs

jours

la coloration de Bailenger

Laisser pendant une nuit en contact

cristal violet 2 g

fuchsine basique 005 g

alcool agrave 95deg 20 ml

pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml

eau distilleacutee 100 ml

Coloration des frottis

Pour bien observer les structures nucleacuteaires et

garder des lames de reacutefeacuterence on

confectionne un frottis de selles humide et

eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en

- 3 temps fixation puis coloration puis

diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)

- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg

Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)

Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag

- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher

soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains

dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)

soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)

soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1

heure)

-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode

-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau

- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3

30 min agrave leacutetuve agrave 37deg

- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece

24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs

-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au

microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent

nettement

-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau

-Deacuteshydrater

-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est

poseacutee deacutefinitivement

- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les

trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure

des noyaux Les kystes apparaissent en bleu

pacircle avec des noyaux bien nets Cest une

technique facile agrave reacutealiser

- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible

- Plonger la lame dans le fixateur colorant de

Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures

- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au

baume de Canada ou au baume syntheacutetique

Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par

Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie

- Seacutechage

- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol

- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid

- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet

- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20

secondes en agitant

- Rinccedilage

-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5

- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100

- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert

Coloration des microscporidies

Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10

- Effectuer un frottis de la selle

- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de

meacutethanol

- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes

- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord

en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml

- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge

Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee

microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-

Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution

- Colorer pendant 3 heures

- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02

-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-

Rincer seacutecher et lire au grossissement x100

Coloration par Uvitex 2B

Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute

pour la chitine Met en eacutevidence les

microsporidie par une fluorescence

directe On obtient une

fluorescence bleue pale sur fond

noir

Scotch test anal ( test de Graham agrave

la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius

vermicularis ainsi que les anneaux ou les

oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors

de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est

appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant

toute toilette en position foetale ou genou

pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus

et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute

sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera

agrave lrsquoobjectif X10

NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les

parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que

la technique devra ecirctre faite avec des gants

ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite

pour eacuteviter la contamination par les oeufs

auto-infestant de lrsquooxyure

Meacutethodes speacuteciales

Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon

eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs

drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle

de la taille drsquoun petit pois

Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen

des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm

dans une quantiteacute de vert malachite agrave

3 (contre colorant) et de glyceacuterine

appliquer la bande sur la selle et sur la

lame renverser et appuyer sur la

paillasse

Methode de Kato-Katz quantitative

utilise un gabarie pour la selle

Meacutethode efficace pour la recherche

doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale

mais inutilisable pour les kytes et les

larves ainsi que les oeufs dankylostome

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

Les meacutethodes de concentrations

Les techniques par lesquelles on

essaie agrave partir de la grande quantiteacute

de la matieres feacutecales recueillies

drsquoobtenir dans un faible volume les

œufs larves kystes voire formes

veacutegeacutetatifs fixeacutees de parasites par

eacutelimination des reacutesidus de la

digestion

Les meacutethodes physiques

Les selles dilueacutees dans un reacuteactif de densiteacute

diffeacuterente de celle de parasite

DR superieur DP = flottation

DR inferieur DP = seacutedimentation

A-Techniques de flottation

Crsquoest une technique part du principe que la densiteacute du liquide et supeacuterieur

agrave celle des parasites ces derniers plus leacutegers flottent agrave la surface

Les principales techniques de flottation

- Meacutethode de Fullborn (1920) elle utilise une solution satureacutee de NaCl

(NaCl 250g ED 750ml d=12)

- Meacutethode de Willis (1921) simple et utilisable en routine

bullDiluer une noisette de selle dans la solution satureacutee de NaCl agrave 25

bullRemplissez un tube en verre conique jusquagrave sonbord en formant un

meacutenisque concave (verre de montre) sur lequel on deacutepose une lamelle

pendant 15 minutes (pas plus pour eacuteviter la cristalisation des oeufs) On la

deacutepose ensuite sur une lame porte objet et on observe agrave lrsquoobjectif X10 agrave la

recherche des OEufs drsquohelminthes tels que ceux drsquoHymenolepis ou

drsquoAnkylstomes

-Meacutethode de Janeckso et Urbanyi(1931) utilise comme reacuteactif une

solution de domercurate de potassium ( d=114) qui doit etre manipuleacutee

avec prudence

Iodo-mercurate de potassium

Bi iodure de mercure 100g

Iodure de potassium 74g

Eau distilleacutee 50 ml

-Meacutethode de Faust (1938) on centrifuge agrave 1500 tm une dilution des

selles dans lrsquoeau ordinaire tieacutede et on rejette le surnageant et on remet le

culot en suspension dans drsquoeau On reacutepegravete lrsquoopeacuteration jusqursquoagrave ce que le

surnageant soit limpide on remet alors le culot en suspension dans le

sulfate de Zink agrave 33 Apreacutes centrifugation on preacutelegraveve agrave lrsquoanse de

platine la pellicule de surfase qursquoon examine au microscope

- Meacutethode drsquoOtto Hwitt et Straham (1941) on procegravede de la meme

maniere que pour le Willis mais avec une solution aqueuse de sulfate

de Zink agrave 33 D=118

Avantage -Technique simple

-Mateacuteriel rudimentaire

- reacutealisation en seacuterie

-Sensibiliteacute treacutes bonne++++

Inconveacutenient

-Elle a ce pendant lrsquoinconveacutenient drsquoalteacuterer des Larves et les

Kystes pour les quels elle est contre-indiqueacutee ( reactifs

hypertoniques) de mecircme que pour les selles liquides ou

riches en lipides

-Elle donne de bons reacutesultats pour les oeufs drsquohelminthes

leacutegers (oeufs drsquoHymenolepis drsquoAnkylostome et deTaelignia)

B-Techniques de seacutedimentation bullLe diluant a une densiteacute inferieure agrave celle du

parasite alors se dernier se seacutedimente

Les principales techniques

- Meacutethode par seacutedimentation simple

- Meacutethode de Faust et IngallsReacutealiseacutee en utilisant

lrsquoeau glyceacuterineacutee (Eau + Glyceacuterine agrave 05) elle

permet drsquoaugmenter la mouillabiliteacute qui facilite la

seacutedimentation des parasites larves Anguillules

Œufs drsquoAscaris non feacutecondeacutes et œufs de

Schistosoma mansoni

-Meacutethode de Baroody et MostSeacutedimentation

centrifugation Eau de robinet chauffeacutee agrave 42degC

- Meacutethode de Jahnes et Hodges

Avantage -Technique simple

-Mateacuteriel rudimentaire

- reacutealisation en seacuterie

- Traitent une grande masse feacutecale ( parasites rares ou irreacuteguliegraverere ment

repartis dans la selle)

Inconveacutenient -une technique longue agrave reacutealiser

-Les cellules veacutegeacutetales seacutedimentent aussi vite que les parasites (Preacutesence

de certains reacutesidus)

-Non indiqueacutes en routine (sensibiliteacute

moyenne++)

Meacutethodes physico-chimiques ou

Diphasiques Caracteacuteriseacutees par la mise en preacutesence de deux

phases non miscibles lrsquoune aqueuse et lrsquoautre

constitueacutee par lrsquoeacutether qui est un solvant des lipidesil

se creacutee un coefficient de partage entre ces deux

phases et la reacutepartition de chaque eacuteleacutement feacutecal dans

chacune drsquoelles sera isoleacutes en fonction de son pouvoir

hydrophile ou lipophile

Bailenger a montreacute que le pH de la solution eacutetait

leacuteleacutement deacuteterminant pour la plus ou moins grande

efficaciteacute dune technique selon le parasite rechercheacute

Principes theacuteoriques

-Les selles tritureacutees (meacutelange au dixiegraveme environ) dans la solution choisie - elle peut ecirctre preacutealablement passeacutee sur un tamis pour eacuteliminer les gros deacutebris

le filtrat est verseacute dans un tube agrave centrifuger agrave fond conique en le remplissant 13

deacutether de maniegravere agrave ce quil y ai 23 du meacutelange selle en laissant 1 cm pour

fermer le tube

- Lrsquoagiter pendant une minute

- La suspension eacutetheacutero-liquide obtenue est centrifugeacutee agrave une vitesse lente de

lordre de 1500 agrave 2000 toursminute pendant une agrave trois minutes

- Apregraves centrifugation les constituants de la suspension sont reacutepartis en quatre

Couches

- Deacutecoller la couche des reacutesidus lipophiles agrave laide dune baguette de verre

- Retourner le tube au dessus de leacutevier (en faisant couler de leau) ou dun bac agrave

deacutechets liquides

- Essuyer les parois du tube avec un coton tenu agrave la pince en laissant toujours le

tube avec louverture dirigeacutee vers le bas pour eacuteviter de souiller le culot avec les

reacutesidus

- Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique pour

remettre en suspension le culot qui sera examineacute

- le culot qui nous inteacuteresse qui contient les eacuteleacutement parasitaires (kystes des

protozoaires)

Ether Debris

Phase aqueuse

Le culot

Les meacutethodes diphasiques sont

-Meacutethode de Telmann 1908

-Meacutethode De Rivas 1928

-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917

-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946

-Meacutethode De Ritchie 1948

-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood

-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf

-Meacutethode De Roman 1957

-Meacutethode de Bailenger 1962-1963

-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle

-Meacutethode de Junod 1927

Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage

Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia

Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)

La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble

lors de la centrifugation ce qui est un argument

diagnostique inteacuteressant

- Inconveacutenients

Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve

restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave

deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses

- Deacuteroulement de la technique

acide aceacutetique cristallisable 5 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethode de Bailenger - Avantages

Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et

des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5

(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)

- Inconveacutenients

Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre

technique est neacutecessaire

- Deacuteroulement de la technique

aceacutetate de sodium 15 g

acide aceacutetique 36 ml

eau distilleacutee qsp 1000 ml

Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide

dun pH-megravetre

Meacutethode de Ritchie simplifieacutee

- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles

formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour

enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les

oeufs dascaris et de schistosome

- Inconveacutenients

Le culot souvent volumineux est de lecture difficile

- Deacuteroulement de la technique

- Solutions de Ritchie

eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt

eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)

Meacutethode de Blagg et al

-Avantages

-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire

les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de

liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de

mercure souille les effluents du laboratoire

- Deacuteroulement de la technique

Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou

additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est

verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation

eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes

Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)

permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute

Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et

recommencer lagitation

On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et

cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee

Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages

-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles

Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes

aiseacutement et facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de

schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue

que les techniques en un temps

- Deacuteroulement de la technique

A) NaCl 9 g

formol officinal 10 ml

eau qsp 1000 ml

B) acide citrique 100 g

formol officinal 20 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethodes combineacutees

Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et

par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande

quantiteacute de selles

Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les

rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des

formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale

- Inconveacutenients

Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez

mal - Deacuteroulement de la technique

A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml

formol officinal 100 ml

eau qsp 1 000 ml

B bromure de sodium cristalliseacute 622 g

eau distilleacutee 1000 ml

Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant

pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou

kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour

trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente

- Inconveacutenients

Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps

assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate

preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)

- Deacuteroulement de la technique

- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)

liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml

eau distilleacutee 334 ml

Concentration diphasique

(MIF ou Bailenger)

une solution de

sulfate de zinc

30 secondes agrave f v

dilueacute au quart avec ED

Examiner

Le culot

Examiner

Le culot

iodomercurate

de potassium

de densiteacute 15

dilueacute au quart avec ED

Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod

simplifieacutee) - Avantages

donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete

- Inconveacutenients

Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi

dune solution de iodomercurate

- Deacuteroulement de la technique

Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)

- aceacutetate de sodium 15 g

- acide aceacutetique cristallisable 20 ml

- formol 40 ml

-eau qsp 1000 ml

Solution B (densiteacute 140)

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 442 volumes

8 g de selles

50 ml de solution de NaCl agrave

85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min

Suspension homo

+Tamisage Examiner

Le culot

eacuteliminer

le surnageant

20 ml dune solution A

+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique

1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min

4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer

le surnageant

Examiner

Le culot

Meacutethode de seacutedimentation-flottation

pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves

- Inconveacutenients

Quand la teneur des selles en lipides est anormalement

eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de

graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique

Solution de densiteacute 135

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 520 volumes

la suspension feacutecale en

eau agrave 85 de NaCl

1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min

1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min

20 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacute

eacuteliminer

le surnageant

5 agrave 7 ml de solution diodomercurate

de potassium de densiteacute 135 20 ml deau

Examen du culot

Seacutedimentation-flottation au saccharose

pour protozoaires - Avantages

permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les

kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand

lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste

na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des

selles fixeacutees au MIF

- Inconveacutenients

Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et

flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De

plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre

que des sels de mercure sont encore utiliseacutes

-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose

saccharose 120 g

eau 200 ml

Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et

utiliser alors

saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml

Suspension homo

+Tamisage +

2 agrave 3 heures

50 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacutee

fraicircche

10 agrave 15 ml de la suspension

1800-2000 toursmin 90sec

rejeter le surnageant

L 1 en12humide

3 agrave 4 g de selles

Seacute

dim

en

tatio

n

8 agrave 10 ml de solution de saccharose

+ 05 ml de solution de chlorure

mercurique agrave 15 en ED

1000 toursmin 45 sec

deacutecanter le

surnageant

dans T2

L 2 en12humide

Flottation

T2 20 agrave 30 ml deau

2000 toursmin90 sec

L 3 en12humide

Preacutecipitation

Les colorations

utile en cas de doute lrsquoidentification des

kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces

des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires

coloreacutees

recommandeacutee pour la conservation de

mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre

laboratoire pour avis

indispensable pour le diagnostic de certains

parasites (Cryptosporides microsporides)

Meacutethodes de coloration rapides

(Colorations en tubes)

- Meacutethode de Bailenger et Faraggi

- Meacutethode de Sapro Lawless et

Strome

-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene

tamporeacute

-Meacutethode de Horkin

- Meacutethode de Sargeaut

-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero

Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de

Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-

formol Apregraves meacutelange

- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave

laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout

-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le

fond du tube

-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en

protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees

immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine

des noyaux est coloreacutee en brun par liode

Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent

donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol

sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement

leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes

- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou

directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension

de selles avec le colorant

Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des

protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux

apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs

jours

la coloration de Bailenger

Laisser pendant une nuit en contact

cristal violet 2 g

fuchsine basique 005 g

alcool agrave 95deg 20 ml

pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml

eau distilleacutee 100 ml

Coloration des frottis

Pour bien observer les structures nucleacuteaires et

garder des lames de reacutefeacuterence on

confectionne un frottis de selles humide et

eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en

- 3 temps fixation puis coloration puis

diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)

- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg

Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)

Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag

- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher

soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains

dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)

soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)

soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1

heure)

-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode

-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau

- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3

30 min agrave leacutetuve agrave 37deg

- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece

24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs

-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au

microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent

nettement

-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau

-Deacuteshydrater

-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est

poseacutee deacutefinitivement

- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les

trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure

des noyaux Les kystes apparaissent en bleu

pacircle avec des noyaux bien nets Cest une

technique facile agrave reacutealiser

- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible

- Plonger la lame dans le fixateur colorant de

Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures

- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au

baume de Canada ou au baume syntheacutetique

Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par

Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie

- Seacutechage

- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol

- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid

- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet

- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20

secondes en agitant

- Rinccedilage

-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5

- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100

- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert

Coloration des microscporidies

Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10

- Effectuer un frottis de la selle

- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de

meacutethanol

- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes

- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord

en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml

- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge

Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee

microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-

Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution

- Colorer pendant 3 heures

- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02

-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-

Rincer seacutecher et lire au grossissement x100

Coloration par Uvitex 2B

Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute

pour la chitine Met en eacutevidence les

microsporidie par une fluorescence

directe On obtient une

fluorescence bleue pale sur fond

noir

Scotch test anal ( test de Graham agrave

la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius

vermicularis ainsi que les anneaux ou les

oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors

de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est

appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant

toute toilette en position foetale ou genou

pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus

et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute

sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera

agrave lrsquoobjectif X10

NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les

parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que

la technique devra ecirctre faite avec des gants

ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite

pour eacuteviter la contamination par les oeufs

auto-infestant de lrsquooxyure

Meacutethodes speacuteciales

Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon

eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs

drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle

de la taille drsquoun petit pois

Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen

des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm

dans une quantiteacute de vert malachite agrave

3 (contre colorant) et de glyceacuterine

appliquer la bande sur la selle et sur la

lame renverser et appuyer sur la

paillasse

Methode de Kato-Katz quantitative

utilise un gabarie pour la selle

Meacutethode efficace pour la recherche

doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale

mais inutilisable pour les kytes et les

larves ainsi que les oeufs dankylostome

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

Les meacutethodes physiques

Les selles dilueacutees dans un reacuteactif de densiteacute

diffeacuterente de celle de parasite

DR superieur DP = flottation

DR inferieur DP = seacutedimentation

A-Techniques de flottation

Crsquoest une technique part du principe que la densiteacute du liquide et supeacuterieur

agrave celle des parasites ces derniers plus leacutegers flottent agrave la surface

Les principales techniques de flottation

- Meacutethode de Fullborn (1920) elle utilise une solution satureacutee de NaCl

(NaCl 250g ED 750ml d=12)

- Meacutethode de Willis (1921) simple et utilisable en routine

bullDiluer une noisette de selle dans la solution satureacutee de NaCl agrave 25

bullRemplissez un tube en verre conique jusquagrave sonbord en formant un

meacutenisque concave (verre de montre) sur lequel on deacutepose une lamelle

pendant 15 minutes (pas plus pour eacuteviter la cristalisation des oeufs) On la

deacutepose ensuite sur une lame porte objet et on observe agrave lrsquoobjectif X10 agrave la

recherche des OEufs drsquohelminthes tels que ceux drsquoHymenolepis ou

drsquoAnkylstomes

-Meacutethode de Janeckso et Urbanyi(1931) utilise comme reacuteactif une

solution de domercurate de potassium ( d=114) qui doit etre manipuleacutee

avec prudence

Iodo-mercurate de potassium

Bi iodure de mercure 100g

Iodure de potassium 74g

Eau distilleacutee 50 ml

-Meacutethode de Faust (1938) on centrifuge agrave 1500 tm une dilution des

selles dans lrsquoeau ordinaire tieacutede et on rejette le surnageant et on remet le

culot en suspension dans drsquoeau On reacutepegravete lrsquoopeacuteration jusqursquoagrave ce que le

surnageant soit limpide on remet alors le culot en suspension dans le

sulfate de Zink agrave 33 Apreacutes centrifugation on preacutelegraveve agrave lrsquoanse de

platine la pellicule de surfase qursquoon examine au microscope

- Meacutethode drsquoOtto Hwitt et Straham (1941) on procegravede de la meme

maniere que pour le Willis mais avec une solution aqueuse de sulfate

de Zink agrave 33 D=118

Avantage -Technique simple

-Mateacuteriel rudimentaire

- reacutealisation en seacuterie

-Sensibiliteacute treacutes bonne++++

Inconveacutenient

-Elle a ce pendant lrsquoinconveacutenient drsquoalteacuterer des Larves et les

Kystes pour les quels elle est contre-indiqueacutee ( reactifs

hypertoniques) de mecircme que pour les selles liquides ou

riches en lipides

-Elle donne de bons reacutesultats pour les oeufs drsquohelminthes

leacutegers (oeufs drsquoHymenolepis drsquoAnkylostome et deTaelignia)

B-Techniques de seacutedimentation bullLe diluant a une densiteacute inferieure agrave celle du

parasite alors se dernier se seacutedimente

Les principales techniques

- Meacutethode par seacutedimentation simple

- Meacutethode de Faust et IngallsReacutealiseacutee en utilisant

lrsquoeau glyceacuterineacutee (Eau + Glyceacuterine agrave 05) elle

permet drsquoaugmenter la mouillabiliteacute qui facilite la

seacutedimentation des parasites larves Anguillules

Œufs drsquoAscaris non feacutecondeacutes et œufs de

Schistosoma mansoni

-Meacutethode de Baroody et MostSeacutedimentation

centrifugation Eau de robinet chauffeacutee agrave 42degC

- Meacutethode de Jahnes et Hodges

Avantage -Technique simple

-Mateacuteriel rudimentaire

- reacutealisation en seacuterie

- Traitent une grande masse feacutecale ( parasites rares ou irreacuteguliegraverere ment

repartis dans la selle)

Inconveacutenient -une technique longue agrave reacutealiser

-Les cellules veacutegeacutetales seacutedimentent aussi vite que les parasites (Preacutesence

de certains reacutesidus)

-Non indiqueacutes en routine (sensibiliteacute

moyenne++)

Meacutethodes physico-chimiques ou

Diphasiques Caracteacuteriseacutees par la mise en preacutesence de deux

phases non miscibles lrsquoune aqueuse et lrsquoautre

constitueacutee par lrsquoeacutether qui est un solvant des lipidesil

se creacutee un coefficient de partage entre ces deux

phases et la reacutepartition de chaque eacuteleacutement feacutecal dans

chacune drsquoelles sera isoleacutes en fonction de son pouvoir

hydrophile ou lipophile

Bailenger a montreacute que le pH de la solution eacutetait

leacuteleacutement deacuteterminant pour la plus ou moins grande

efficaciteacute dune technique selon le parasite rechercheacute

Principes theacuteoriques

-Les selles tritureacutees (meacutelange au dixiegraveme environ) dans la solution choisie - elle peut ecirctre preacutealablement passeacutee sur un tamis pour eacuteliminer les gros deacutebris

le filtrat est verseacute dans un tube agrave centrifuger agrave fond conique en le remplissant 13

deacutether de maniegravere agrave ce quil y ai 23 du meacutelange selle en laissant 1 cm pour

fermer le tube

- Lrsquoagiter pendant une minute

- La suspension eacutetheacutero-liquide obtenue est centrifugeacutee agrave une vitesse lente de

lordre de 1500 agrave 2000 toursminute pendant une agrave trois minutes

- Apregraves centrifugation les constituants de la suspension sont reacutepartis en quatre

Couches

- Deacutecoller la couche des reacutesidus lipophiles agrave laide dune baguette de verre

- Retourner le tube au dessus de leacutevier (en faisant couler de leau) ou dun bac agrave

deacutechets liquides

- Essuyer les parois du tube avec un coton tenu agrave la pince en laissant toujours le

tube avec louverture dirigeacutee vers le bas pour eacuteviter de souiller le culot avec les

reacutesidus

- Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique pour

remettre en suspension le culot qui sera examineacute

- le culot qui nous inteacuteresse qui contient les eacuteleacutement parasitaires (kystes des

protozoaires)

Ether Debris

Phase aqueuse

Le culot

Les meacutethodes diphasiques sont

-Meacutethode de Telmann 1908

-Meacutethode De Rivas 1928

-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917

-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946

-Meacutethode De Ritchie 1948

-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood

-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf

-Meacutethode De Roman 1957

-Meacutethode de Bailenger 1962-1963

-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle

-Meacutethode de Junod 1927

Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage

Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia

Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)

La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble

lors de la centrifugation ce qui est un argument

diagnostique inteacuteressant

- Inconveacutenients

Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve

restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave

deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses

- Deacuteroulement de la technique

acide aceacutetique cristallisable 5 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethode de Bailenger - Avantages

Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et

des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5

(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)

- Inconveacutenients

Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre

technique est neacutecessaire

- Deacuteroulement de la technique

aceacutetate de sodium 15 g

acide aceacutetique 36 ml

eau distilleacutee qsp 1000 ml

Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide

dun pH-megravetre

Meacutethode de Ritchie simplifieacutee

- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles

formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour

enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les

oeufs dascaris et de schistosome

- Inconveacutenients

Le culot souvent volumineux est de lecture difficile

- Deacuteroulement de la technique

- Solutions de Ritchie

eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt

eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)

Meacutethode de Blagg et al

-Avantages

-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire

les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de

liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de

mercure souille les effluents du laboratoire

- Deacuteroulement de la technique

Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou

additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est

verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation

eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes

Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)

permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute

Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et

recommencer lagitation

On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et

cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee

Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages

-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles

Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes

aiseacutement et facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de

schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue

que les techniques en un temps

- Deacuteroulement de la technique

A) NaCl 9 g

formol officinal 10 ml

eau qsp 1000 ml

B) acide citrique 100 g

formol officinal 20 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethodes combineacutees

Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et

par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande

quantiteacute de selles

Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les

rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des

formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale

- Inconveacutenients

Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez

mal - Deacuteroulement de la technique

A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml

formol officinal 100 ml

eau qsp 1 000 ml

B bromure de sodium cristalliseacute 622 g

eau distilleacutee 1000 ml

Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant

pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou

kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour

trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente

- Inconveacutenients

Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps

assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate

preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)

- Deacuteroulement de la technique

- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)

liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml

eau distilleacutee 334 ml

Concentration diphasique

(MIF ou Bailenger)

une solution de

sulfate de zinc

30 secondes agrave f v

dilueacute au quart avec ED

Examiner

Le culot

Examiner

Le culot

iodomercurate

de potassium

de densiteacute 15

dilueacute au quart avec ED

Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod

simplifieacutee) - Avantages

donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete

- Inconveacutenients

Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi

dune solution de iodomercurate

- Deacuteroulement de la technique

Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)

- aceacutetate de sodium 15 g

- acide aceacutetique cristallisable 20 ml

- formol 40 ml

-eau qsp 1000 ml

Solution B (densiteacute 140)

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 442 volumes

8 g de selles

50 ml de solution de NaCl agrave

85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min

Suspension homo

+Tamisage Examiner

Le culot

eacuteliminer

le surnageant

20 ml dune solution A

+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique

1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min

4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer

le surnageant

Examiner

Le culot

Meacutethode de seacutedimentation-flottation

pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves

- Inconveacutenients

Quand la teneur des selles en lipides est anormalement

eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de

graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique

Solution de densiteacute 135

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 520 volumes

la suspension feacutecale en

eau agrave 85 de NaCl

1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min

1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min

20 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacute

eacuteliminer

le surnageant

5 agrave 7 ml de solution diodomercurate

de potassium de densiteacute 135 20 ml deau

Examen du culot

Seacutedimentation-flottation au saccharose

pour protozoaires - Avantages

permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les

kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand

lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste

na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des

selles fixeacutees au MIF

- Inconveacutenients

Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et

flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De

plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre

que des sels de mercure sont encore utiliseacutes

-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose

saccharose 120 g

eau 200 ml

Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et

utiliser alors

saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml

Suspension homo

+Tamisage +

2 agrave 3 heures

50 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacutee

fraicircche

10 agrave 15 ml de la suspension

1800-2000 toursmin 90sec

rejeter le surnageant

L 1 en12humide

3 agrave 4 g de selles

Seacute

dim

en

tatio

n

8 agrave 10 ml de solution de saccharose

+ 05 ml de solution de chlorure

mercurique agrave 15 en ED

1000 toursmin 45 sec

deacutecanter le

surnageant

dans T2

L 2 en12humide

Flottation

T2 20 agrave 30 ml deau

2000 toursmin90 sec

L 3 en12humide

Preacutecipitation

Les colorations

utile en cas de doute lrsquoidentification des

kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces

des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires

coloreacutees

recommandeacutee pour la conservation de

mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre

laboratoire pour avis

indispensable pour le diagnostic de certains

parasites (Cryptosporides microsporides)

Meacutethodes de coloration rapides

(Colorations en tubes)

- Meacutethode de Bailenger et Faraggi

- Meacutethode de Sapro Lawless et

Strome

-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene

tamporeacute

-Meacutethode de Horkin

- Meacutethode de Sargeaut

-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero

Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de

Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-

formol Apregraves meacutelange

- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave

laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout

-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le

fond du tube

-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en

protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees

immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine

des noyaux est coloreacutee en brun par liode

Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent

donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol

sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement

leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes

- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou

directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension

de selles avec le colorant

Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des

protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux

apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs

jours

la coloration de Bailenger

Laisser pendant une nuit en contact

cristal violet 2 g

fuchsine basique 005 g

alcool agrave 95deg 20 ml

pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml

eau distilleacutee 100 ml

Coloration des frottis

Pour bien observer les structures nucleacuteaires et

garder des lames de reacutefeacuterence on

confectionne un frottis de selles humide et

eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en

- 3 temps fixation puis coloration puis

diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)

- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg

Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)

Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag

- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher

soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains

dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)

soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)

soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1

heure)

-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode

-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau

- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3

30 min agrave leacutetuve agrave 37deg

- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece

24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs

-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au

microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent

nettement

-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau

-Deacuteshydrater

-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est

poseacutee deacutefinitivement

- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les

trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure

des noyaux Les kystes apparaissent en bleu

pacircle avec des noyaux bien nets Cest une

technique facile agrave reacutealiser

- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible

- Plonger la lame dans le fixateur colorant de

Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures

- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au

baume de Canada ou au baume syntheacutetique

Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par

Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie

- Seacutechage

- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol

- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid

- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet

- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20

secondes en agitant

- Rinccedilage

-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5

- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100

- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert

Coloration des microscporidies

Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10

- Effectuer un frottis de la selle

- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de

meacutethanol

- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes

- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord

en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml

- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge

Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee

microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-

Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution

- Colorer pendant 3 heures

- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02

-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-

Rincer seacutecher et lire au grossissement x100

Coloration par Uvitex 2B

Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute

pour la chitine Met en eacutevidence les

microsporidie par une fluorescence

directe On obtient une

fluorescence bleue pale sur fond

noir

Scotch test anal ( test de Graham agrave

la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius

vermicularis ainsi que les anneaux ou les

oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors

de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est

appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant

toute toilette en position foetale ou genou

pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus

et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute

sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera

agrave lrsquoobjectif X10

NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les

parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que

la technique devra ecirctre faite avec des gants

ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite

pour eacuteviter la contamination par les oeufs

auto-infestant de lrsquooxyure

Meacutethodes speacuteciales

Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon

eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs

drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle

de la taille drsquoun petit pois

Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen

des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm

dans une quantiteacute de vert malachite agrave

3 (contre colorant) et de glyceacuterine

appliquer la bande sur la selle et sur la

lame renverser et appuyer sur la

paillasse

Methode de Kato-Katz quantitative

utilise un gabarie pour la selle

Meacutethode efficace pour la recherche

doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale

mais inutilisable pour les kytes et les

larves ainsi que les oeufs dankylostome

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

A-Techniques de flottation

Crsquoest une technique part du principe que la densiteacute du liquide et supeacuterieur

agrave celle des parasites ces derniers plus leacutegers flottent agrave la surface

Les principales techniques de flottation

- Meacutethode de Fullborn (1920) elle utilise une solution satureacutee de NaCl

(NaCl 250g ED 750ml d=12)

- Meacutethode de Willis (1921) simple et utilisable en routine

bullDiluer une noisette de selle dans la solution satureacutee de NaCl agrave 25

bullRemplissez un tube en verre conique jusquagrave sonbord en formant un

meacutenisque concave (verre de montre) sur lequel on deacutepose une lamelle

pendant 15 minutes (pas plus pour eacuteviter la cristalisation des oeufs) On la

deacutepose ensuite sur une lame porte objet et on observe agrave lrsquoobjectif X10 agrave la

recherche des OEufs drsquohelminthes tels que ceux drsquoHymenolepis ou

drsquoAnkylstomes

-Meacutethode de Janeckso et Urbanyi(1931) utilise comme reacuteactif une

solution de domercurate de potassium ( d=114) qui doit etre manipuleacutee

avec prudence

Iodo-mercurate de potassium

Bi iodure de mercure 100g

Iodure de potassium 74g

Eau distilleacutee 50 ml

-Meacutethode de Faust (1938) on centrifuge agrave 1500 tm une dilution des

selles dans lrsquoeau ordinaire tieacutede et on rejette le surnageant et on remet le

culot en suspension dans drsquoeau On reacutepegravete lrsquoopeacuteration jusqursquoagrave ce que le

surnageant soit limpide on remet alors le culot en suspension dans le

sulfate de Zink agrave 33 Apreacutes centrifugation on preacutelegraveve agrave lrsquoanse de

platine la pellicule de surfase qursquoon examine au microscope

- Meacutethode drsquoOtto Hwitt et Straham (1941) on procegravede de la meme

maniere que pour le Willis mais avec une solution aqueuse de sulfate

de Zink agrave 33 D=118

Avantage -Technique simple

-Mateacuteriel rudimentaire

- reacutealisation en seacuterie

-Sensibiliteacute treacutes bonne++++

Inconveacutenient

-Elle a ce pendant lrsquoinconveacutenient drsquoalteacuterer des Larves et les

Kystes pour les quels elle est contre-indiqueacutee ( reactifs

hypertoniques) de mecircme que pour les selles liquides ou

riches en lipides

-Elle donne de bons reacutesultats pour les oeufs drsquohelminthes

leacutegers (oeufs drsquoHymenolepis drsquoAnkylostome et deTaelignia)

B-Techniques de seacutedimentation bullLe diluant a une densiteacute inferieure agrave celle du

parasite alors se dernier se seacutedimente

Les principales techniques

- Meacutethode par seacutedimentation simple

- Meacutethode de Faust et IngallsReacutealiseacutee en utilisant

lrsquoeau glyceacuterineacutee (Eau + Glyceacuterine agrave 05) elle

permet drsquoaugmenter la mouillabiliteacute qui facilite la

seacutedimentation des parasites larves Anguillules

Œufs drsquoAscaris non feacutecondeacutes et œufs de

Schistosoma mansoni

-Meacutethode de Baroody et MostSeacutedimentation

centrifugation Eau de robinet chauffeacutee agrave 42degC

- Meacutethode de Jahnes et Hodges

Avantage -Technique simple

-Mateacuteriel rudimentaire

- reacutealisation en seacuterie

- Traitent une grande masse feacutecale ( parasites rares ou irreacuteguliegraverere ment

repartis dans la selle)

Inconveacutenient -une technique longue agrave reacutealiser

-Les cellules veacutegeacutetales seacutedimentent aussi vite que les parasites (Preacutesence

de certains reacutesidus)

-Non indiqueacutes en routine (sensibiliteacute

moyenne++)

Meacutethodes physico-chimiques ou

Diphasiques Caracteacuteriseacutees par la mise en preacutesence de deux

phases non miscibles lrsquoune aqueuse et lrsquoautre

constitueacutee par lrsquoeacutether qui est un solvant des lipidesil

se creacutee un coefficient de partage entre ces deux

phases et la reacutepartition de chaque eacuteleacutement feacutecal dans

chacune drsquoelles sera isoleacutes en fonction de son pouvoir

hydrophile ou lipophile

Bailenger a montreacute que le pH de la solution eacutetait

leacuteleacutement deacuteterminant pour la plus ou moins grande

efficaciteacute dune technique selon le parasite rechercheacute

Principes theacuteoriques

-Les selles tritureacutees (meacutelange au dixiegraveme environ) dans la solution choisie - elle peut ecirctre preacutealablement passeacutee sur un tamis pour eacuteliminer les gros deacutebris

le filtrat est verseacute dans un tube agrave centrifuger agrave fond conique en le remplissant 13

deacutether de maniegravere agrave ce quil y ai 23 du meacutelange selle en laissant 1 cm pour

fermer le tube

- Lrsquoagiter pendant une minute

- La suspension eacutetheacutero-liquide obtenue est centrifugeacutee agrave une vitesse lente de

lordre de 1500 agrave 2000 toursminute pendant une agrave trois minutes

- Apregraves centrifugation les constituants de la suspension sont reacutepartis en quatre

Couches

- Deacutecoller la couche des reacutesidus lipophiles agrave laide dune baguette de verre

- Retourner le tube au dessus de leacutevier (en faisant couler de leau) ou dun bac agrave

deacutechets liquides

- Essuyer les parois du tube avec un coton tenu agrave la pince en laissant toujours le

tube avec louverture dirigeacutee vers le bas pour eacuteviter de souiller le culot avec les

reacutesidus

- Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique pour

remettre en suspension le culot qui sera examineacute

- le culot qui nous inteacuteresse qui contient les eacuteleacutement parasitaires (kystes des

protozoaires)

Ether Debris

Phase aqueuse

Le culot

Les meacutethodes diphasiques sont

-Meacutethode de Telmann 1908

-Meacutethode De Rivas 1928

-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917

-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946

-Meacutethode De Ritchie 1948

-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood

-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf

-Meacutethode De Roman 1957

-Meacutethode de Bailenger 1962-1963

-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle

-Meacutethode de Junod 1927

Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage

Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia

Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)

La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble

lors de la centrifugation ce qui est un argument

diagnostique inteacuteressant

- Inconveacutenients

Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve

restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave

deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses

- Deacuteroulement de la technique

acide aceacutetique cristallisable 5 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethode de Bailenger - Avantages

Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et

des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5

(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)

- Inconveacutenients

Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre

technique est neacutecessaire

- Deacuteroulement de la technique

aceacutetate de sodium 15 g

acide aceacutetique 36 ml

eau distilleacutee qsp 1000 ml

Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide

dun pH-megravetre

Meacutethode de Ritchie simplifieacutee

- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles

formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour

enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les

oeufs dascaris et de schistosome

- Inconveacutenients

Le culot souvent volumineux est de lecture difficile

- Deacuteroulement de la technique

- Solutions de Ritchie

eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt

eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)

Meacutethode de Blagg et al

-Avantages

-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire

les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de

liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de

mercure souille les effluents du laboratoire

- Deacuteroulement de la technique

Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou

additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est

verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation

eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes

Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)

permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute

Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et

recommencer lagitation

On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et

cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee

Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages

-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles

Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes

aiseacutement et facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de

schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue

que les techniques en un temps

- Deacuteroulement de la technique

A) NaCl 9 g

formol officinal 10 ml

eau qsp 1000 ml

B) acide citrique 100 g

formol officinal 20 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethodes combineacutees

Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et

par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande

quantiteacute de selles

Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les

rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des

formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale

- Inconveacutenients

Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez

mal - Deacuteroulement de la technique

A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml

formol officinal 100 ml

eau qsp 1 000 ml

B bromure de sodium cristalliseacute 622 g

eau distilleacutee 1000 ml

Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant

pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou

kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour

trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente

- Inconveacutenients

Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps

assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate

preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)

- Deacuteroulement de la technique

- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)

liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml

eau distilleacutee 334 ml

Concentration diphasique

(MIF ou Bailenger)

une solution de

sulfate de zinc

30 secondes agrave f v

dilueacute au quart avec ED

Examiner

Le culot

Examiner

Le culot

iodomercurate

de potassium

de densiteacute 15

dilueacute au quart avec ED

Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod

simplifieacutee) - Avantages

donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete

- Inconveacutenients

Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi

dune solution de iodomercurate

- Deacuteroulement de la technique

Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)

- aceacutetate de sodium 15 g

- acide aceacutetique cristallisable 20 ml

- formol 40 ml

-eau qsp 1000 ml

Solution B (densiteacute 140)

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 442 volumes

8 g de selles

50 ml de solution de NaCl agrave

85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min

Suspension homo

+Tamisage Examiner

Le culot

eacuteliminer

le surnageant

20 ml dune solution A

+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique

1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min

4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer

le surnageant

Examiner

Le culot

Meacutethode de seacutedimentation-flottation

pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves

- Inconveacutenients

Quand la teneur des selles en lipides est anormalement

eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de

graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique

Solution de densiteacute 135

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 520 volumes

la suspension feacutecale en

eau agrave 85 de NaCl

1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min

1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min

20 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacute

eacuteliminer

le surnageant

5 agrave 7 ml de solution diodomercurate

de potassium de densiteacute 135 20 ml deau

Examen du culot

Seacutedimentation-flottation au saccharose

pour protozoaires - Avantages

permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les

kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand

lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste

na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des

selles fixeacutees au MIF

- Inconveacutenients

Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et

flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De

plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre

que des sels de mercure sont encore utiliseacutes

-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose

saccharose 120 g

eau 200 ml

Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et

utiliser alors

saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml

Suspension homo

+Tamisage +

2 agrave 3 heures

50 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacutee

fraicircche

10 agrave 15 ml de la suspension

1800-2000 toursmin 90sec

rejeter le surnageant

L 1 en12humide

3 agrave 4 g de selles

Seacute

dim

en

tatio

n

8 agrave 10 ml de solution de saccharose

+ 05 ml de solution de chlorure

mercurique agrave 15 en ED

1000 toursmin 45 sec

deacutecanter le

surnageant

dans T2

L 2 en12humide

Flottation

T2 20 agrave 30 ml deau

2000 toursmin90 sec

L 3 en12humide

Preacutecipitation

Les colorations

utile en cas de doute lrsquoidentification des

kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces

des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires

coloreacutees

recommandeacutee pour la conservation de

mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre

laboratoire pour avis

indispensable pour le diagnostic de certains

parasites (Cryptosporides microsporides)

Meacutethodes de coloration rapides

(Colorations en tubes)

- Meacutethode de Bailenger et Faraggi

- Meacutethode de Sapro Lawless et

Strome

-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene

tamporeacute

-Meacutethode de Horkin

- Meacutethode de Sargeaut

-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero

Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de

Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-

formol Apregraves meacutelange

- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave

laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout

-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le

fond du tube

-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en

protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees

immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine

des noyaux est coloreacutee en brun par liode

Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent

donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol

sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement

leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes

- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou

directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension

de selles avec le colorant

Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des

protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux

apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs

jours

la coloration de Bailenger

Laisser pendant une nuit en contact

cristal violet 2 g

fuchsine basique 005 g

alcool agrave 95deg 20 ml

pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml

eau distilleacutee 100 ml

Coloration des frottis

Pour bien observer les structures nucleacuteaires et

garder des lames de reacutefeacuterence on

confectionne un frottis de selles humide et

eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en

- 3 temps fixation puis coloration puis

diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)

- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg

Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)

Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag

- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher

soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains

dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)

soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)

soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1

heure)

-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode

-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau

- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3

30 min agrave leacutetuve agrave 37deg

- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece

24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs

-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au

microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent

nettement

-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau

-Deacuteshydrater

-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est

poseacutee deacutefinitivement

- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les

trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure

des noyaux Les kystes apparaissent en bleu

pacircle avec des noyaux bien nets Cest une

technique facile agrave reacutealiser

- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible

- Plonger la lame dans le fixateur colorant de

Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures

- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au

baume de Canada ou au baume syntheacutetique

Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par

Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie

- Seacutechage

- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol

- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid

- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet

- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20

secondes en agitant

- Rinccedilage

-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5

- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100

- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert

Coloration des microscporidies

Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10

- Effectuer un frottis de la selle

- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de

meacutethanol

- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes

- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord

en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml

- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge

Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee

microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-

Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution

- Colorer pendant 3 heures

- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02

-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-

Rincer seacutecher et lire au grossissement x100

Coloration par Uvitex 2B

Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute

pour la chitine Met en eacutevidence les

microsporidie par une fluorescence

directe On obtient une

fluorescence bleue pale sur fond

noir

Scotch test anal ( test de Graham agrave

la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius

vermicularis ainsi que les anneaux ou les

oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors

de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est

appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant

toute toilette en position foetale ou genou

pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus

et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute

sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera

agrave lrsquoobjectif X10

NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les

parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que

la technique devra ecirctre faite avec des gants

ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite

pour eacuteviter la contamination par les oeufs

auto-infestant de lrsquooxyure

Meacutethodes speacuteciales

Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon

eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs

drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle

de la taille drsquoun petit pois

Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen

des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm

dans une quantiteacute de vert malachite agrave

3 (contre colorant) et de glyceacuterine

appliquer la bande sur la selle et sur la

lame renverser et appuyer sur la

paillasse

Methode de Kato-Katz quantitative

utilise un gabarie pour la selle

Meacutethode efficace pour la recherche

doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale

mais inutilisable pour les kytes et les

larves ainsi que les oeufs dankylostome

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

-Meacutethode de Janeckso et Urbanyi(1931) utilise comme reacuteactif une

solution de domercurate de potassium ( d=114) qui doit etre manipuleacutee

avec prudence

Iodo-mercurate de potassium

Bi iodure de mercure 100g

Iodure de potassium 74g

Eau distilleacutee 50 ml

-Meacutethode de Faust (1938) on centrifuge agrave 1500 tm une dilution des

selles dans lrsquoeau ordinaire tieacutede et on rejette le surnageant et on remet le

culot en suspension dans drsquoeau On reacutepegravete lrsquoopeacuteration jusqursquoagrave ce que le

surnageant soit limpide on remet alors le culot en suspension dans le

sulfate de Zink agrave 33 Apreacutes centrifugation on preacutelegraveve agrave lrsquoanse de

platine la pellicule de surfase qursquoon examine au microscope

- Meacutethode drsquoOtto Hwitt et Straham (1941) on procegravede de la meme

maniere que pour le Willis mais avec une solution aqueuse de sulfate

de Zink agrave 33 D=118

Avantage -Technique simple

-Mateacuteriel rudimentaire

- reacutealisation en seacuterie

-Sensibiliteacute treacutes bonne++++

Inconveacutenient

-Elle a ce pendant lrsquoinconveacutenient drsquoalteacuterer des Larves et les

Kystes pour les quels elle est contre-indiqueacutee ( reactifs

hypertoniques) de mecircme que pour les selles liquides ou

riches en lipides

-Elle donne de bons reacutesultats pour les oeufs drsquohelminthes

leacutegers (oeufs drsquoHymenolepis drsquoAnkylostome et deTaelignia)

B-Techniques de seacutedimentation bullLe diluant a une densiteacute inferieure agrave celle du

parasite alors se dernier se seacutedimente

Les principales techniques

- Meacutethode par seacutedimentation simple

- Meacutethode de Faust et IngallsReacutealiseacutee en utilisant

lrsquoeau glyceacuterineacutee (Eau + Glyceacuterine agrave 05) elle

permet drsquoaugmenter la mouillabiliteacute qui facilite la

seacutedimentation des parasites larves Anguillules

Œufs drsquoAscaris non feacutecondeacutes et œufs de

Schistosoma mansoni

-Meacutethode de Baroody et MostSeacutedimentation

centrifugation Eau de robinet chauffeacutee agrave 42degC

- Meacutethode de Jahnes et Hodges

Avantage -Technique simple

-Mateacuteriel rudimentaire

- reacutealisation en seacuterie

- Traitent une grande masse feacutecale ( parasites rares ou irreacuteguliegraverere ment

repartis dans la selle)

Inconveacutenient -une technique longue agrave reacutealiser

-Les cellules veacutegeacutetales seacutedimentent aussi vite que les parasites (Preacutesence

de certains reacutesidus)

-Non indiqueacutes en routine (sensibiliteacute

moyenne++)

Meacutethodes physico-chimiques ou

Diphasiques Caracteacuteriseacutees par la mise en preacutesence de deux

phases non miscibles lrsquoune aqueuse et lrsquoautre

constitueacutee par lrsquoeacutether qui est un solvant des lipidesil

se creacutee un coefficient de partage entre ces deux

phases et la reacutepartition de chaque eacuteleacutement feacutecal dans

chacune drsquoelles sera isoleacutes en fonction de son pouvoir

hydrophile ou lipophile

Bailenger a montreacute que le pH de la solution eacutetait

leacuteleacutement deacuteterminant pour la plus ou moins grande

efficaciteacute dune technique selon le parasite rechercheacute

Principes theacuteoriques

-Les selles tritureacutees (meacutelange au dixiegraveme environ) dans la solution choisie - elle peut ecirctre preacutealablement passeacutee sur un tamis pour eacuteliminer les gros deacutebris

le filtrat est verseacute dans un tube agrave centrifuger agrave fond conique en le remplissant 13

deacutether de maniegravere agrave ce quil y ai 23 du meacutelange selle en laissant 1 cm pour

fermer le tube

- Lrsquoagiter pendant une minute

- La suspension eacutetheacutero-liquide obtenue est centrifugeacutee agrave une vitesse lente de

lordre de 1500 agrave 2000 toursminute pendant une agrave trois minutes

- Apregraves centrifugation les constituants de la suspension sont reacutepartis en quatre

Couches

- Deacutecoller la couche des reacutesidus lipophiles agrave laide dune baguette de verre

- Retourner le tube au dessus de leacutevier (en faisant couler de leau) ou dun bac agrave

deacutechets liquides

- Essuyer les parois du tube avec un coton tenu agrave la pince en laissant toujours le

tube avec louverture dirigeacutee vers le bas pour eacuteviter de souiller le culot avec les

reacutesidus

- Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique pour

remettre en suspension le culot qui sera examineacute

- le culot qui nous inteacuteresse qui contient les eacuteleacutement parasitaires (kystes des

protozoaires)

Ether Debris

Phase aqueuse

Le culot

Les meacutethodes diphasiques sont

-Meacutethode de Telmann 1908

-Meacutethode De Rivas 1928

-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917

-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946

-Meacutethode De Ritchie 1948

-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood

-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf

-Meacutethode De Roman 1957

-Meacutethode de Bailenger 1962-1963

-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle

-Meacutethode de Junod 1927

Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage

Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia

Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)

La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble

lors de la centrifugation ce qui est un argument

diagnostique inteacuteressant

- Inconveacutenients

Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve

restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave

deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses

- Deacuteroulement de la technique

acide aceacutetique cristallisable 5 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethode de Bailenger - Avantages

Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et

des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5

(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)

- Inconveacutenients

Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre

technique est neacutecessaire

- Deacuteroulement de la technique

aceacutetate de sodium 15 g

acide aceacutetique 36 ml

eau distilleacutee qsp 1000 ml

Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide

dun pH-megravetre

Meacutethode de Ritchie simplifieacutee

- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles

formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour

enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les

oeufs dascaris et de schistosome

- Inconveacutenients

Le culot souvent volumineux est de lecture difficile

- Deacuteroulement de la technique

- Solutions de Ritchie

eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt

eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)

Meacutethode de Blagg et al

-Avantages

-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire

les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de

liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de

mercure souille les effluents du laboratoire

- Deacuteroulement de la technique

Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou

additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est

verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation

eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes

Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)

permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute

Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et

recommencer lagitation

On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et

cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee

Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages

-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles

Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes

aiseacutement et facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de

schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue

que les techniques en un temps

- Deacuteroulement de la technique

A) NaCl 9 g

formol officinal 10 ml

eau qsp 1000 ml

B) acide citrique 100 g

formol officinal 20 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethodes combineacutees

Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et

par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande

quantiteacute de selles

Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les

rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des

formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale

- Inconveacutenients

Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez

mal - Deacuteroulement de la technique

A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml

formol officinal 100 ml

eau qsp 1 000 ml

B bromure de sodium cristalliseacute 622 g

eau distilleacutee 1000 ml

Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant

pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou

kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour

trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente

- Inconveacutenients

Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps

assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate

preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)

- Deacuteroulement de la technique

- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)

liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml

eau distilleacutee 334 ml

Concentration diphasique

(MIF ou Bailenger)

une solution de

sulfate de zinc

30 secondes agrave f v

dilueacute au quart avec ED

Examiner

Le culot

Examiner

Le culot

iodomercurate

de potassium

de densiteacute 15

dilueacute au quart avec ED

Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod

simplifieacutee) - Avantages

donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete

- Inconveacutenients

Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi

dune solution de iodomercurate

- Deacuteroulement de la technique

Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)

- aceacutetate de sodium 15 g

- acide aceacutetique cristallisable 20 ml

- formol 40 ml

-eau qsp 1000 ml

Solution B (densiteacute 140)

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 442 volumes

8 g de selles

50 ml de solution de NaCl agrave

85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min

Suspension homo

+Tamisage Examiner

Le culot

eacuteliminer

le surnageant

20 ml dune solution A

+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique

1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min

4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer

le surnageant

Examiner

Le culot

Meacutethode de seacutedimentation-flottation

pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves

- Inconveacutenients

Quand la teneur des selles en lipides est anormalement

eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de

graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique

Solution de densiteacute 135

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 520 volumes

la suspension feacutecale en

eau agrave 85 de NaCl

1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min

1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min

20 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacute

eacuteliminer

le surnageant

5 agrave 7 ml de solution diodomercurate

de potassium de densiteacute 135 20 ml deau

Examen du culot

Seacutedimentation-flottation au saccharose

pour protozoaires - Avantages

permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les

kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand

lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste

na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des

selles fixeacutees au MIF

- Inconveacutenients

Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et

flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De

plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre

que des sels de mercure sont encore utiliseacutes

-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose

saccharose 120 g

eau 200 ml

Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et

utiliser alors

saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml

Suspension homo

+Tamisage +

2 agrave 3 heures

50 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacutee

fraicircche

10 agrave 15 ml de la suspension

1800-2000 toursmin 90sec

rejeter le surnageant

L 1 en12humide

3 agrave 4 g de selles

Seacute

dim

en

tatio

n

8 agrave 10 ml de solution de saccharose

+ 05 ml de solution de chlorure

mercurique agrave 15 en ED

1000 toursmin 45 sec

deacutecanter le

surnageant

dans T2

L 2 en12humide

Flottation

T2 20 agrave 30 ml deau

2000 toursmin90 sec

L 3 en12humide

Preacutecipitation

Les colorations

utile en cas de doute lrsquoidentification des

kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces

des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires

coloreacutees

recommandeacutee pour la conservation de

mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre

laboratoire pour avis

indispensable pour le diagnostic de certains

parasites (Cryptosporides microsporides)

Meacutethodes de coloration rapides

(Colorations en tubes)

- Meacutethode de Bailenger et Faraggi

- Meacutethode de Sapro Lawless et

Strome

-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene

tamporeacute

-Meacutethode de Horkin

- Meacutethode de Sargeaut

-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero

Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de

Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-

formol Apregraves meacutelange

- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave

laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout

-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le

fond du tube

-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en

protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees

immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine

des noyaux est coloreacutee en brun par liode

Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent

donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol

sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement

leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes

- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou

directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension

de selles avec le colorant

Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des

protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux

apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs

jours

la coloration de Bailenger

Laisser pendant une nuit en contact

cristal violet 2 g

fuchsine basique 005 g

alcool agrave 95deg 20 ml

pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml

eau distilleacutee 100 ml

Coloration des frottis

Pour bien observer les structures nucleacuteaires et

garder des lames de reacutefeacuterence on

confectionne un frottis de selles humide et

eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en

- 3 temps fixation puis coloration puis

diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)

- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg

Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)

Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag

- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher

soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains

dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)

soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)

soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1

heure)

-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode

-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau

- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3

30 min agrave leacutetuve agrave 37deg

- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece

24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs

-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au

microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent

nettement

-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau

-Deacuteshydrater

-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est

poseacutee deacutefinitivement

- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les

trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure

des noyaux Les kystes apparaissent en bleu

pacircle avec des noyaux bien nets Cest une

technique facile agrave reacutealiser

- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible

- Plonger la lame dans le fixateur colorant de

Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures

- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au

baume de Canada ou au baume syntheacutetique

Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par

Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie

- Seacutechage

- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol

- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid

- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet

- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20

secondes en agitant

- Rinccedilage

-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5

- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100

- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert

Coloration des microscporidies

Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10

- Effectuer un frottis de la selle

- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de

meacutethanol

- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes

- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord

en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml

- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge

Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee

microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-

Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution

- Colorer pendant 3 heures

- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02

-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-

Rincer seacutecher et lire au grossissement x100

Coloration par Uvitex 2B

Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute

pour la chitine Met en eacutevidence les

microsporidie par une fluorescence

directe On obtient une

fluorescence bleue pale sur fond

noir

Scotch test anal ( test de Graham agrave

la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius

vermicularis ainsi que les anneaux ou les

oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors

de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est

appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant

toute toilette en position foetale ou genou

pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus

et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute

sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera

agrave lrsquoobjectif X10

NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les

parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que

la technique devra ecirctre faite avec des gants

ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite

pour eacuteviter la contamination par les oeufs

auto-infestant de lrsquooxyure

Meacutethodes speacuteciales

Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon

eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs

drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle

de la taille drsquoun petit pois

Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen

des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm

dans une quantiteacute de vert malachite agrave

3 (contre colorant) et de glyceacuterine

appliquer la bande sur la selle et sur la

lame renverser et appuyer sur la

paillasse

Methode de Kato-Katz quantitative

utilise un gabarie pour la selle

Meacutethode efficace pour la recherche

doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale

mais inutilisable pour les kytes et les

larves ainsi que les oeufs dankylostome

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

Avantage -Technique simple

-Mateacuteriel rudimentaire

- reacutealisation en seacuterie

-Sensibiliteacute treacutes bonne++++

Inconveacutenient

-Elle a ce pendant lrsquoinconveacutenient drsquoalteacuterer des Larves et les

Kystes pour les quels elle est contre-indiqueacutee ( reactifs

hypertoniques) de mecircme que pour les selles liquides ou

riches en lipides

-Elle donne de bons reacutesultats pour les oeufs drsquohelminthes

leacutegers (oeufs drsquoHymenolepis drsquoAnkylostome et deTaelignia)

B-Techniques de seacutedimentation bullLe diluant a une densiteacute inferieure agrave celle du

parasite alors se dernier se seacutedimente

Les principales techniques

- Meacutethode par seacutedimentation simple

- Meacutethode de Faust et IngallsReacutealiseacutee en utilisant

lrsquoeau glyceacuterineacutee (Eau + Glyceacuterine agrave 05) elle

permet drsquoaugmenter la mouillabiliteacute qui facilite la

seacutedimentation des parasites larves Anguillules

Œufs drsquoAscaris non feacutecondeacutes et œufs de

Schistosoma mansoni

-Meacutethode de Baroody et MostSeacutedimentation

centrifugation Eau de robinet chauffeacutee agrave 42degC

- Meacutethode de Jahnes et Hodges

Avantage -Technique simple

-Mateacuteriel rudimentaire

- reacutealisation en seacuterie

- Traitent une grande masse feacutecale ( parasites rares ou irreacuteguliegraverere ment

repartis dans la selle)

Inconveacutenient -une technique longue agrave reacutealiser

-Les cellules veacutegeacutetales seacutedimentent aussi vite que les parasites (Preacutesence

de certains reacutesidus)

-Non indiqueacutes en routine (sensibiliteacute

moyenne++)

Meacutethodes physico-chimiques ou

Diphasiques Caracteacuteriseacutees par la mise en preacutesence de deux

phases non miscibles lrsquoune aqueuse et lrsquoautre

constitueacutee par lrsquoeacutether qui est un solvant des lipidesil

se creacutee un coefficient de partage entre ces deux

phases et la reacutepartition de chaque eacuteleacutement feacutecal dans

chacune drsquoelles sera isoleacutes en fonction de son pouvoir

hydrophile ou lipophile

Bailenger a montreacute que le pH de la solution eacutetait

leacuteleacutement deacuteterminant pour la plus ou moins grande

efficaciteacute dune technique selon le parasite rechercheacute

Principes theacuteoriques

-Les selles tritureacutees (meacutelange au dixiegraveme environ) dans la solution choisie - elle peut ecirctre preacutealablement passeacutee sur un tamis pour eacuteliminer les gros deacutebris

le filtrat est verseacute dans un tube agrave centrifuger agrave fond conique en le remplissant 13

deacutether de maniegravere agrave ce quil y ai 23 du meacutelange selle en laissant 1 cm pour

fermer le tube

- Lrsquoagiter pendant une minute

- La suspension eacutetheacutero-liquide obtenue est centrifugeacutee agrave une vitesse lente de

lordre de 1500 agrave 2000 toursminute pendant une agrave trois minutes

- Apregraves centrifugation les constituants de la suspension sont reacutepartis en quatre

Couches

- Deacutecoller la couche des reacutesidus lipophiles agrave laide dune baguette de verre

- Retourner le tube au dessus de leacutevier (en faisant couler de leau) ou dun bac agrave

deacutechets liquides

- Essuyer les parois du tube avec un coton tenu agrave la pince en laissant toujours le

tube avec louverture dirigeacutee vers le bas pour eacuteviter de souiller le culot avec les

reacutesidus

- Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique pour

remettre en suspension le culot qui sera examineacute

- le culot qui nous inteacuteresse qui contient les eacuteleacutement parasitaires (kystes des

protozoaires)

Ether Debris

Phase aqueuse

Le culot

Les meacutethodes diphasiques sont

-Meacutethode de Telmann 1908

-Meacutethode De Rivas 1928

-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917

-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946

-Meacutethode De Ritchie 1948

-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood

-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf

-Meacutethode De Roman 1957

-Meacutethode de Bailenger 1962-1963

-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle

-Meacutethode de Junod 1927

Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage

Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia

Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)

La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble

lors de la centrifugation ce qui est un argument

diagnostique inteacuteressant

- Inconveacutenients

Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve

restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave

deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses

- Deacuteroulement de la technique

acide aceacutetique cristallisable 5 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethode de Bailenger - Avantages

Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et

des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5

(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)

- Inconveacutenients

Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre

technique est neacutecessaire

- Deacuteroulement de la technique

aceacutetate de sodium 15 g

acide aceacutetique 36 ml

eau distilleacutee qsp 1000 ml

Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide

dun pH-megravetre

Meacutethode de Ritchie simplifieacutee

- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles

formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour

enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les

oeufs dascaris et de schistosome

- Inconveacutenients

Le culot souvent volumineux est de lecture difficile

- Deacuteroulement de la technique

- Solutions de Ritchie

eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt

eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)

Meacutethode de Blagg et al

-Avantages

-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire

les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de

liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de

mercure souille les effluents du laboratoire

- Deacuteroulement de la technique

Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou

additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est

verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation

eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes

Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)

permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute

Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et

recommencer lagitation

On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et

cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee

Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages

-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles

Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes

aiseacutement et facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de

schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue

que les techniques en un temps

- Deacuteroulement de la technique

A) NaCl 9 g

formol officinal 10 ml

eau qsp 1000 ml

B) acide citrique 100 g

formol officinal 20 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethodes combineacutees

Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et

par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande

quantiteacute de selles

Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les

rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des

formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale

- Inconveacutenients

Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez

mal - Deacuteroulement de la technique

A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml

formol officinal 100 ml

eau qsp 1 000 ml

B bromure de sodium cristalliseacute 622 g

eau distilleacutee 1000 ml

Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant

pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou

kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour

trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente

- Inconveacutenients

Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps

assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate

preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)

- Deacuteroulement de la technique

- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)

liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml

eau distilleacutee 334 ml

Concentration diphasique

(MIF ou Bailenger)

une solution de

sulfate de zinc

30 secondes agrave f v

dilueacute au quart avec ED

Examiner

Le culot

Examiner

Le culot

iodomercurate

de potassium

de densiteacute 15

dilueacute au quart avec ED

Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod

simplifieacutee) - Avantages

donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete

- Inconveacutenients

Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi

dune solution de iodomercurate

- Deacuteroulement de la technique

Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)

- aceacutetate de sodium 15 g

- acide aceacutetique cristallisable 20 ml

- formol 40 ml

-eau qsp 1000 ml

Solution B (densiteacute 140)

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 442 volumes

8 g de selles

50 ml de solution de NaCl agrave

85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min

Suspension homo

+Tamisage Examiner

Le culot

eacuteliminer

le surnageant

20 ml dune solution A

+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique

1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min

4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer

le surnageant

Examiner

Le culot

Meacutethode de seacutedimentation-flottation

pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves

- Inconveacutenients

Quand la teneur des selles en lipides est anormalement

eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de

graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique

Solution de densiteacute 135

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 520 volumes

la suspension feacutecale en

eau agrave 85 de NaCl

1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min

1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min

20 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacute

eacuteliminer

le surnageant

5 agrave 7 ml de solution diodomercurate

de potassium de densiteacute 135 20 ml deau

Examen du culot

Seacutedimentation-flottation au saccharose

pour protozoaires - Avantages

permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les

kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand

lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste

na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des

selles fixeacutees au MIF

- Inconveacutenients

Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et

flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De

plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre

que des sels de mercure sont encore utiliseacutes

-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose

saccharose 120 g

eau 200 ml

Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et

utiliser alors

saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml

Suspension homo

+Tamisage +

2 agrave 3 heures

50 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacutee

fraicircche

10 agrave 15 ml de la suspension

1800-2000 toursmin 90sec

rejeter le surnageant

L 1 en12humide

3 agrave 4 g de selles

Seacute

dim

en

tatio

n

8 agrave 10 ml de solution de saccharose

+ 05 ml de solution de chlorure

mercurique agrave 15 en ED

1000 toursmin 45 sec

deacutecanter le

surnageant

dans T2

L 2 en12humide

Flottation

T2 20 agrave 30 ml deau

2000 toursmin90 sec

L 3 en12humide

Preacutecipitation

Les colorations

utile en cas de doute lrsquoidentification des

kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces

des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires

coloreacutees

recommandeacutee pour la conservation de

mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre

laboratoire pour avis

indispensable pour le diagnostic de certains

parasites (Cryptosporides microsporides)

Meacutethodes de coloration rapides

(Colorations en tubes)

- Meacutethode de Bailenger et Faraggi

- Meacutethode de Sapro Lawless et

Strome

-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene

tamporeacute

-Meacutethode de Horkin

- Meacutethode de Sargeaut

-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero

Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de

Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-

formol Apregraves meacutelange

- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave

laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout

-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le

fond du tube

-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en

protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees

immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine

des noyaux est coloreacutee en brun par liode

Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent

donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol

sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement

leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes

- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou

directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension

de selles avec le colorant

Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des

protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux

apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs

jours

la coloration de Bailenger

Laisser pendant une nuit en contact

cristal violet 2 g

fuchsine basique 005 g

alcool agrave 95deg 20 ml

pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml

eau distilleacutee 100 ml

Coloration des frottis

Pour bien observer les structures nucleacuteaires et

garder des lames de reacutefeacuterence on

confectionne un frottis de selles humide et

eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en

- 3 temps fixation puis coloration puis

diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)

- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg

Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)

Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag

- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher

soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains

dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)

soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)

soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1

heure)

-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode

-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau

- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3

30 min agrave leacutetuve agrave 37deg

- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece

24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs

-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au

microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent

nettement

-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau

-Deacuteshydrater

-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est

poseacutee deacutefinitivement

- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les

trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure

des noyaux Les kystes apparaissent en bleu

pacircle avec des noyaux bien nets Cest une

technique facile agrave reacutealiser

- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible

- Plonger la lame dans le fixateur colorant de

Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures

- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au

baume de Canada ou au baume syntheacutetique

Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par

Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie

- Seacutechage

- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol

- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid

- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet

- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20

secondes en agitant

- Rinccedilage

-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5

- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100

- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert

Coloration des microscporidies

Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10

- Effectuer un frottis de la selle

- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de

meacutethanol

- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes

- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord

en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml

- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge

Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee

microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-

Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution

- Colorer pendant 3 heures

- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02

-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-

Rincer seacutecher et lire au grossissement x100

Coloration par Uvitex 2B

Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute

pour la chitine Met en eacutevidence les

microsporidie par une fluorescence

directe On obtient une

fluorescence bleue pale sur fond

noir

Scotch test anal ( test de Graham agrave

la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius

vermicularis ainsi que les anneaux ou les

oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors

de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est

appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant

toute toilette en position foetale ou genou

pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus

et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute

sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera

agrave lrsquoobjectif X10

NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les

parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que

la technique devra ecirctre faite avec des gants

ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite

pour eacuteviter la contamination par les oeufs

auto-infestant de lrsquooxyure

Meacutethodes speacuteciales

Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon

eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs

drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle

de la taille drsquoun petit pois

Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen

des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm

dans une quantiteacute de vert malachite agrave

3 (contre colorant) et de glyceacuterine

appliquer la bande sur la selle et sur la

lame renverser et appuyer sur la

paillasse

Methode de Kato-Katz quantitative

utilise un gabarie pour la selle

Meacutethode efficace pour la recherche

doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale

mais inutilisable pour les kytes et les

larves ainsi que les oeufs dankylostome

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

B-Techniques de seacutedimentation bullLe diluant a une densiteacute inferieure agrave celle du

parasite alors se dernier se seacutedimente

Les principales techniques

- Meacutethode par seacutedimentation simple

- Meacutethode de Faust et IngallsReacutealiseacutee en utilisant

lrsquoeau glyceacuterineacutee (Eau + Glyceacuterine agrave 05) elle

permet drsquoaugmenter la mouillabiliteacute qui facilite la

seacutedimentation des parasites larves Anguillules

Œufs drsquoAscaris non feacutecondeacutes et œufs de

Schistosoma mansoni

-Meacutethode de Baroody et MostSeacutedimentation

centrifugation Eau de robinet chauffeacutee agrave 42degC

- Meacutethode de Jahnes et Hodges

Avantage -Technique simple

-Mateacuteriel rudimentaire

- reacutealisation en seacuterie

- Traitent une grande masse feacutecale ( parasites rares ou irreacuteguliegraverere ment

repartis dans la selle)

Inconveacutenient -une technique longue agrave reacutealiser

-Les cellules veacutegeacutetales seacutedimentent aussi vite que les parasites (Preacutesence

de certains reacutesidus)

-Non indiqueacutes en routine (sensibiliteacute

moyenne++)

Meacutethodes physico-chimiques ou

Diphasiques Caracteacuteriseacutees par la mise en preacutesence de deux

phases non miscibles lrsquoune aqueuse et lrsquoautre

constitueacutee par lrsquoeacutether qui est un solvant des lipidesil

se creacutee un coefficient de partage entre ces deux

phases et la reacutepartition de chaque eacuteleacutement feacutecal dans

chacune drsquoelles sera isoleacutes en fonction de son pouvoir

hydrophile ou lipophile

Bailenger a montreacute que le pH de la solution eacutetait

leacuteleacutement deacuteterminant pour la plus ou moins grande

efficaciteacute dune technique selon le parasite rechercheacute

Principes theacuteoriques

-Les selles tritureacutees (meacutelange au dixiegraveme environ) dans la solution choisie - elle peut ecirctre preacutealablement passeacutee sur un tamis pour eacuteliminer les gros deacutebris

le filtrat est verseacute dans un tube agrave centrifuger agrave fond conique en le remplissant 13

deacutether de maniegravere agrave ce quil y ai 23 du meacutelange selle en laissant 1 cm pour

fermer le tube

- Lrsquoagiter pendant une minute

- La suspension eacutetheacutero-liquide obtenue est centrifugeacutee agrave une vitesse lente de

lordre de 1500 agrave 2000 toursminute pendant une agrave trois minutes

- Apregraves centrifugation les constituants de la suspension sont reacutepartis en quatre

Couches

- Deacutecoller la couche des reacutesidus lipophiles agrave laide dune baguette de verre

- Retourner le tube au dessus de leacutevier (en faisant couler de leau) ou dun bac agrave

deacutechets liquides

- Essuyer les parois du tube avec un coton tenu agrave la pince en laissant toujours le

tube avec louverture dirigeacutee vers le bas pour eacuteviter de souiller le culot avec les

reacutesidus

- Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique pour

remettre en suspension le culot qui sera examineacute

- le culot qui nous inteacuteresse qui contient les eacuteleacutement parasitaires (kystes des

protozoaires)

Ether Debris

Phase aqueuse

Le culot

Les meacutethodes diphasiques sont

-Meacutethode de Telmann 1908

-Meacutethode De Rivas 1928

-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917

-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946

-Meacutethode De Ritchie 1948

-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood

-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf

-Meacutethode De Roman 1957

-Meacutethode de Bailenger 1962-1963

-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle

-Meacutethode de Junod 1927

Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage

Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia

Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)

La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble

lors de la centrifugation ce qui est un argument

diagnostique inteacuteressant

- Inconveacutenients

Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve

restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave

deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses

- Deacuteroulement de la technique

acide aceacutetique cristallisable 5 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethode de Bailenger - Avantages

Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et

des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5

(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)

- Inconveacutenients

Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre

technique est neacutecessaire

- Deacuteroulement de la technique

aceacutetate de sodium 15 g

acide aceacutetique 36 ml

eau distilleacutee qsp 1000 ml

Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide

dun pH-megravetre

Meacutethode de Ritchie simplifieacutee

- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles

formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour

enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les

oeufs dascaris et de schistosome

- Inconveacutenients

Le culot souvent volumineux est de lecture difficile

- Deacuteroulement de la technique

- Solutions de Ritchie

eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt

eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)

Meacutethode de Blagg et al

-Avantages

-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire

les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de

liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de

mercure souille les effluents du laboratoire

- Deacuteroulement de la technique

Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou

additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est

verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation

eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes

Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)

permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute

Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et

recommencer lagitation

On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et

cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee

Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages

-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles

Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes

aiseacutement et facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de

schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue

que les techniques en un temps

- Deacuteroulement de la technique

A) NaCl 9 g

formol officinal 10 ml

eau qsp 1000 ml

B) acide citrique 100 g

formol officinal 20 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethodes combineacutees

Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et

par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande

quantiteacute de selles

Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les

rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des

formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale

- Inconveacutenients

Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez

mal - Deacuteroulement de la technique

A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml

formol officinal 100 ml

eau qsp 1 000 ml

B bromure de sodium cristalliseacute 622 g

eau distilleacutee 1000 ml

Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant

pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou

kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour

trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente

- Inconveacutenients

Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps

assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate

preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)

- Deacuteroulement de la technique

- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)

liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml

eau distilleacutee 334 ml

Concentration diphasique

(MIF ou Bailenger)

une solution de

sulfate de zinc

30 secondes agrave f v

dilueacute au quart avec ED

Examiner

Le culot

Examiner

Le culot

iodomercurate

de potassium

de densiteacute 15

dilueacute au quart avec ED

Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod

simplifieacutee) - Avantages

donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete

- Inconveacutenients

Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi

dune solution de iodomercurate

- Deacuteroulement de la technique

Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)

- aceacutetate de sodium 15 g

- acide aceacutetique cristallisable 20 ml

- formol 40 ml

-eau qsp 1000 ml

Solution B (densiteacute 140)

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 442 volumes

8 g de selles

50 ml de solution de NaCl agrave

85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min

Suspension homo

+Tamisage Examiner

Le culot

eacuteliminer

le surnageant

20 ml dune solution A

+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique

1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min

4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer

le surnageant

Examiner

Le culot

Meacutethode de seacutedimentation-flottation

pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves

- Inconveacutenients

Quand la teneur des selles en lipides est anormalement

eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de

graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique

Solution de densiteacute 135

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 520 volumes

la suspension feacutecale en

eau agrave 85 de NaCl

1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min

1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min

20 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacute

eacuteliminer

le surnageant

5 agrave 7 ml de solution diodomercurate

de potassium de densiteacute 135 20 ml deau

Examen du culot

Seacutedimentation-flottation au saccharose

pour protozoaires - Avantages

permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les

kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand

lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste

na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des

selles fixeacutees au MIF

- Inconveacutenients

Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et

flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De

plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre

que des sels de mercure sont encore utiliseacutes

-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose

saccharose 120 g

eau 200 ml

Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et

utiliser alors

saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml

Suspension homo

+Tamisage +

2 agrave 3 heures

50 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacutee

fraicircche

10 agrave 15 ml de la suspension

1800-2000 toursmin 90sec

rejeter le surnageant

L 1 en12humide

3 agrave 4 g de selles

Seacute

dim

en

tatio

n

8 agrave 10 ml de solution de saccharose

+ 05 ml de solution de chlorure

mercurique agrave 15 en ED

1000 toursmin 45 sec

deacutecanter le

surnageant

dans T2

L 2 en12humide

Flottation

T2 20 agrave 30 ml deau

2000 toursmin90 sec

L 3 en12humide

Preacutecipitation

Les colorations

utile en cas de doute lrsquoidentification des

kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces

des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires

coloreacutees

recommandeacutee pour la conservation de

mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre

laboratoire pour avis

indispensable pour le diagnostic de certains

parasites (Cryptosporides microsporides)

Meacutethodes de coloration rapides

(Colorations en tubes)

- Meacutethode de Bailenger et Faraggi

- Meacutethode de Sapro Lawless et

Strome

-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene

tamporeacute

-Meacutethode de Horkin

- Meacutethode de Sargeaut

-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero

Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de

Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-

formol Apregraves meacutelange

- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave

laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout

-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le

fond du tube

-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en

protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees

immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine

des noyaux est coloreacutee en brun par liode

Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent

donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol

sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement

leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes

- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou

directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension

de selles avec le colorant

Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des

protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux

apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs

jours

la coloration de Bailenger

Laisser pendant une nuit en contact

cristal violet 2 g

fuchsine basique 005 g

alcool agrave 95deg 20 ml

pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml

eau distilleacutee 100 ml

Coloration des frottis

Pour bien observer les structures nucleacuteaires et

garder des lames de reacutefeacuterence on

confectionne un frottis de selles humide et

eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en

- 3 temps fixation puis coloration puis

diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)

- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg

Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)

Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag

- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher

soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains

dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)

soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)

soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1

heure)

-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode

-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau

- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3

30 min agrave leacutetuve agrave 37deg

- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece

24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs

-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au

microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent

nettement

-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau

-Deacuteshydrater

-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est

poseacutee deacutefinitivement

- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les

trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure

des noyaux Les kystes apparaissent en bleu

pacircle avec des noyaux bien nets Cest une

technique facile agrave reacutealiser

- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible

- Plonger la lame dans le fixateur colorant de

Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures

- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au

baume de Canada ou au baume syntheacutetique

Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par

Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie

- Seacutechage

- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol

- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid

- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet

- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20

secondes en agitant

- Rinccedilage

-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5

- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100

- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert

Coloration des microscporidies

Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10

- Effectuer un frottis de la selle

- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de

meacutethanol

- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes

- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord

en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml

- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge

Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee

microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-

Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution

- Colorer pendant 3 heures

- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02

-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-

Rincer seacutecher et lire au grossissement x100

Coloration par Uvitex 2B

Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute

pour la chitine Met en eacutevidence les

microsporidie par une fluorescence

directe On obtient une

fluorescence bleue pale sur fond

noir

Scotch test anal ( test de Graham agrave

la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius

vermicularis ainsi que les anneaux ou les

oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors

de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est

appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant

toute toilette en position foetale ou genou

pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus

et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute

sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera

agrave lrsquoobjectif X10

NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les

parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que

la technique devra ecirctre faite avec des gants

ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite

pour eacuteviter la contamination par les oeufs

auto-infestant de lrsquooxyure

Meacutethodes speacuteciales

Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon

eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs

drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle

de la taille drsquoun petit pois

Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen

des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm

dans une quantiteacute de vert malachite agrave

3 (contre colorant) et de glyceacuterine

appliquer la bande sur la selle et sur la

lame renverser et appuyer sur la

paillasse

Methode de Kato-Katz quantitative

utilise un gabarie pour la selle

Meacutethode efficace pour la recherche

doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale

mais inutilisable pour les kytes et les

larves ainsi que les oeufs dankylostome

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

Avantage -Technique simple

-Mateacuteriel rudimentaire

- reacutealisation en seacuterie

- Traitent une grande masse feacutecale ( parasites rares ou irreacuteguliegraverere ment

repartis dans la selle)

Inconveacutenient -une technique longue agrave reacutealiser

-Les cellules veacutegeacutetales seacutedimentent aussi vite que les parasites (Preacutesence

de certains reacutesidus)

-Non indiqueacutes en routine (sensibiliteacute

moyenne++)

Meacutethodes physico-chimiques ou

Diphasiques Caracteacuteriseacutees par la mise en preacutesence de deux

phases non miscibles lrsquoune aqueuse et lrsquoautre

constitueacutee par lrsquoeacutether qui est un solvant des lipidesil

se creacutee un coefficient de partage entre ces deux

phases et la reacutepartition de chaque eacuteleacutement feacutecal dans

chacune drsquoelles sera isoleacutes en fonction de son pouvoir

hydrophile ou lipophile

Bailenger a montreacute que le pH de la solution eacutetait

leacuteleacutement deacuteterminant pour la plus ou moins grande

efficaciteacute dune technique selon le parasite rechercheacute

Principes theacuteoriques

-Les selles tritureacutees (meacutelange au dixiegraveme environ) dans la solution choisie - elle peut ecirctre preacutealablement passeacutee sur un tamis pour eacuteliminer les gros deacutebris

le filtrat est verseacute dans un tube agrave centrifuger agrave fond conique en le remplissant 13

deacutether de maniegravere agrave ce quil y ai 23 du meacutelange selle en laissant 1 cm pour

fermer le tube

- Lrsquoagiter pendant une minute

- La suspension eacutetheacutero-liquide obtenue est centrifugeacutee agrave une vitesse lente de

lordre de 1500 agrave 2000 toursminute pendant une agrave trois minutes

- Apregraves centrifugation les constituants de la suspension sont reacutepartis en quatre

Couches

- Deacutecoller la couche des reacutesidus lipophiles agrave laide dune baguette de verre

- Retourner le tube au dessus de leacutevier (en faisant couler de leau) ou dun bac agrave

deacutechets liquides

- Essuyer les parois du tube avec un coton tenu agrave la pince en laissant toujours le

tube avec louverture dirigeacutee vers le bas pour eacuteviter de souiller le culot avec les

reacutesidus

- Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique pour

remettre en suspension le culot qui sera examineacute

- le culot qui nous inteacuteresse qui contient les eacuteleacutement parasitaires (kystes des

protozoaires)

Ether Debris

Phase aqueuse

Le culot

Les meacutethodes diphasiques sont

-Meacutethode de Telmann 1908

-Meacutethode De Rivas 1928

-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917

-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946

-Meacutethode De Ritchie 1948

-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood

-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf

-Meacutethode De Roman 1957

-Meacutethode de Bailenger 1962-1963

-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle

-Meacutethode de Junod 1927

Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage

Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia

Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)

La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble

lors de la centrifugation ce qui est un argument

diagnostique inteacuteressant

- Inconveacutenients

Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve

restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave

deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses

- Deacuteroulement de la technique

acide aceacutetique cristallisable 5 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethode de Bailenger - Avantages

Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et

des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5

(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)

- Inconveacutenients

Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre

technique est neacutecessaire

- Deacuteroulement de la technique

aceacutetate de sodium 15 g

acide aceacutetique 36 ml

eau distilleacutee qsp 1000 ml

Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide

dun pH-megravetre

Meacutethode de Ritchie simplifieacutee

- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles

formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour

enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les

oeufs dascaris et de schistosome

- Inconveacutenients

Le culot souvent volumineux est de lecture difficile

- Deacuteroulement de la technique

- Solutions de Ritchie

eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt

eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)

Meacutethode de Blagg et al

-Avantages

-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire

les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de

liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de

mercure souille les effluents du laboratoire

- Deacuteroulement de la technique

Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou

additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est

verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation

eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes

Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)

permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute

Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et

recommencer lagitation

On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et

cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee

Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages

-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles

Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes

aiseacutement et facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de

schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue

que les techniques en un temps

- Deacuteroulement de la technique

A) NaCl 9 g

formol officinal 10 ml

eau qsp 1000 ml

B) acide citrique 100 g

formol officinal 20 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethodes combineacutees

Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et

par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande

quantiteacute de selles

Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les

rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des

formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale

- Inconveacutenients

Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez

mal - Deacuteroulement de la technique

A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml

formol officinal 100 ml

eau qsp 1 000 ml

B bromure de sodium cristalliseacute 622 g

eau distilleacutee 1000 ml

Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant

pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou

kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour

trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente

- Inconveacutenients

Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps

assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate

preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)

- Deacuteroulement de la technique

- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)

liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml

eau distilleacutee 334 ml

Concentration diphasique

(MIF ou Bailenger)

une solution de

sulfate de zinc

30 secondes agrave f v

dilueacute au quart avec ED

Examiner

Le culot

Examiner

Le culot

iodomercurate

de potassium

de densiteacute 15

dilueacute au quart avec ED

Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod

simplifieacutee) - Avantages

donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete

- Inconveacutenients

Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi

dune solution de iodomercurate

- Deacuteroulement de la technique

Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)

- aceacutetate de sodium 15 g

- acide aceacutetique cristallisable 20 ml

- formol 40 ml

-eau qsp 1000 ml

Solution B (densiteacute 140)

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 442 volumes

8 g de selles

50 ml de solution de NaCl agrave

85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min

Suspension homo

+Tamisage Examiner

Le culot

eacuteliminer

le surnageant

20 ml dune solution A

+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique

1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min

4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer

le surnageant

Examiner

Le culot

Meacutethode de seacutedimentation-flottation

pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves

- Inconveacutenients

Quand la teneur des selles en lipides est anormalement

eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de

graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique

Solution de densiteacute 135

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 520 volumes

la suspension feacutecale en

eau agrave 85 de NaCl

1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min

1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min

20 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacute

eacuteliminer

le surnageant

5 agrave 7 ml de solution diodomercurate

de potassium de densiteacute 135 20 ml deau

Examen du culot

Seacutedimentation-flottation au saccharose

pour protozoaires - Avantages

permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les

kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand

lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste

na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des

selles fixeacutees au MIF

- Inconveacutenients

Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et

flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De

plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre

que des sels de mercure sont encore utiliseacutes

-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose

saccharose 120 g

eau 200 ml

Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et

utiliser alors

saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml

Suspension homo

+Tamisage +

2 agrave 3 heures

50 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacutee

fraicircche

10 agrave 15 ml de la suspension

1800-2000 toursmin 90sec

rejeter le surnageant

L 1 en12humide

3 agrave 4 g de selles

Seacute

dim

en

tatio

n

8 agrave 10 ml de solution de saccharose

+ 05 ml de solution de chlorure

mercurique agrave 15 en ED

1000 toursmin 45 sec

deacutecanter le

surnageant

dans T2

L 2 en12humide

Flottation

T2 20 agrave 30 ml deau

2000 toursmin90 sec

L 3 en12humide

Preacutecipitation

Les colorations

utile en cas de doute lrsquoidentification des

kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces

des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires

coloreacutees

recommandeacutee pour la conservation de

mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre

laboratoire pour avis

indispensable pour le diagnostic de certains

parasites (Cryptosporides microsporides)

Meacutethodes de coloration rapides

(Colorations en tubes)

- Meacutethode de Bailenger et Faraggi

- Meacutethode de Sapro Lawless et

Strome

-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene

tamporeacute

-Meacutethode de Horkin

- Meacutethode de Sargeaut

-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero

Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de

Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-

formol Apregraves meacutelange

- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave

laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout

-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le

fond du tube

-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en

protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees

immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine

des noyaux est coloreacutee en brun par liode

Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent

donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol

sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement

leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes

- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou

directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension

de selles avec le colorant

Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des

protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux

apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs

jours

la coloration de Bailenger

Laisser pendant une nuit en contact

cristal violet 2 g

fuchsine basique 005 g

alcool agrave 95deg 20 ml

pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml

eau distilleacutee 100 ml

Coloration des frottis

Pour bien observer les structures nucleacuteaires et

garder des lames de reacutefeacuterence on

confectionne un frottis de selles humide et

eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en

- 3 temps fixation puis coloration puis

diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)

- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg

Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)

Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag

- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher

soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains

dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)

soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)

soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1

heure)

-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode

-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau

- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3

30 min agrave leacutetuve agrave 37deg

- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece

24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs

-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au

microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent

nettement

-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau

-Deacuteshydrater

-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est

poseacutee deacutefinitivement

- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les

trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure

des noyaux Les kystes apparaissent en bleu

pacircle avec des noyaux bien nets Cest une

technique facile agrave reacutealiser

- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible

- Plonger la lame dans le fixateur colorant de

Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures

- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au

baume de Canada ou au baume syntheacutetique

Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par

Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie

- Seacutechage

- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol

- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid

- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet

- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20

secondes en agitant

- Rinccedilage

-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5

- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100

- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert

Coloration des microscporidies

Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10

- Effectuer un frottis de la selle

- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de

meacutethanol

- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes

- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord

en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml

- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge

Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee

microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-

Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution

- Colorer pendant 3 heures

- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02

-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-

Rincer seacutecher et lire au grossissement x100

Coloration par Uvitex 2B

Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute

pour la chitine Met en eacutevidence les

microsporidie par une fluorescence

directe On obtient une

fluorescence bleue pale sur fond

noir

Scotch test anal ( test de Graham agrave

la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius

vermicularis ainsi que les anneaux ou les

oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors

de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est

appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant

toute toilette en position foetale ou genou

pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus

et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute

sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera

agrave lrsquoobjectif X10

NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les

parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que

la technique devra ecirctre faite avec des gants

ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite

pour eacuteviter la contamination par les oeufs

auto-infestant de lrsquooxyure

Meacutethodes speacuteciales

Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon

eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs

drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle

de la taille drsquoun petit pois

Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen

des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm

dans une quantiteacute de vert malachite agrave

3 (contre colorant) et de glyceacuterine

appliquer la bande sur la selle et sur la

lame renverser et appuyer sur la

paillasse

Methode de Kato-Katz quantitative

utilise un gabarie pour la selle

Meacutethode efficace pour la recherche

doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale

mais inutilisable pour les kytes et les

larves ainsi que les oeufs dankylostome

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

Meacutethodes physico-chimiques ou

Diphasiques Caracteacuteriseacutees par la mise en preacutesence de deux

phases non miscibles lrsquoune aqueuse et lrsquoautre

constitueacutee par lrsquoeacutether qui est un solvant des lipidesil

se creacutee un coefficient de partage entre ces deux

phases et la reacutepartition de chaque eacuteleacutement feacutecal dans

chacune drsquoelles sera isoleacutes en fonction de son pouvoir

hydrophile ou lipophile

Bailenger a montreacute que le pH de la solution eacutetait

leacuteleacutement deacuteterminant pour la plus ou moins grande

efficaciteacute dune technique selon le parasite rechercheacute

Principes theacuteoriques

-Les selles tritureacutees (meacutelange au dixiegraveme environ) dans la solution choisie - elle peut ecirctre preacutealablement passeacutee sur un tamis pour eacuteliminer les gros deacutebris

le filtrat est verseacute dans un tube agrave centrifuger agrave fond conique en le remplissant 13

deacutether de maniegravere agrave ce quil y ai 23 du meacutelange selle en laissant 1 cm pour

fermer le tube

- Lrsquoagiter pendant une minute

- La suspension eacutetheacutero-liquide obtenue est centrifugeacutee agrave une vitesse lente de

lordre de 1500 agrave 2000 toursminute pendant une agrave trois minutes

- Apregraves centrifugation les constituants de la suspension sont reacutepartis en quatre

Couches

- Deacutecoller la couche des reacutesidus lipophiles agrave laide dune baguette de verre

- Retourner le tube au dessus de leacutevier (en faisant couler de leau) ou dun bac agrave

deacutechets liquides

- Essuyer les parois du tube avec un coton tenu agrave la pince en laissant toujours le

tube avec louverture dirigeacutee vers le bas pour eacuteviter de souiller le culot avec les

reacutesidus

- Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique pour

remettre en suspension le culot qui sera examineacute

- le culot qui nous inteacuteresse qui contient les eacuteleacutement parasitaires (kystes des

protozoaires)

Ether Debris

Phase aqueuse

Le culot

Les meacutethodes diphasiques sont

-Meacutethode de Telmann 1908

-Meacutethode De Rivas 1928

-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917

-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946

-Meacutethode De Ritchie 1948

-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood

-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf

-Meacutethode De Roman 1957

-Meacutethode de Bailenger 1962-1963

-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle

-Meacutethode de Junod 1927

Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage

Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia

Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)

La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble

lors de la centrifugation ce qui est un argument

diagnostique inteacuteressant

- Inconveacutenients

Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve

restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave

deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses

- Deacuteroulement de la technique

acide aceacutetique cristallisable 5 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethode de Bailenger - Avantages

Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et

des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5

(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)

- Inconveacutenients

Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre

technique est neacutecessaire

- Deacuteroulement de la technique

aceacutetate de sodium 15 g

acide aceacutetique 36 ml

eau distilleacutee qsp 1000 ml

Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide

dun pH-megravetre

Meacutethode de Ritchie simplifieacutee

- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles

formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour

enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les

oeufs dascaris et de schistosome

- Inconveacutenients

Le culot souvent volumineux est de lecture difficile

- Deacuteroulement de la technique

- Solutions de Ritchie

eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt

eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)

Meacutethode de Blagg et al

-Avantages

-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire

les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de

liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de

mercure souille les effluents du laboratoire

- Deacuteroulement de la technique

Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou

additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est

verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation

eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes

Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)

permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute

Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et

recommencer lagitation

On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et

cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee

Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages

-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles

Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes

aiseacutement et facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de

schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue

que les techniques en un temps

- Deacuteroulement de la technique

A) NaCl 9 g

formol officinal 10 ml

eau qsp 1000 ml

B) acide citrique 100 g

formol officinal 20 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethodes combineacutees

Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et

par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande

quantiteacute de selles

Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les

rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des

formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale

- Inconveacutenients

Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez

mal - Deacuteroulement de la technique

A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml

formol officinal 100 ml

eau qsp 1 000 ml

B bromure de sodium cristalliseacute 622 g

eau distilleacutee 1000 ml

Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant

pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou

kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour

trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente

- Inconveacutenients

Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps

assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate

preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)

- Deacuteroulement de la technique

- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)

liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml

eau distilleacutee 334 ml

Concentration diphasique

(MIF ou Bailenger)

une solution de

sulfate de zinc

30 secondes agrave f v

dilueacute au quart avec ED

Examiner

Le culot

Examiner

Le culot

iodomercurate

de potassium

de densiteacute 15

dilueacute au quart avec ED

Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod

simplifieacutee) - Avantages

donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete

- Inconveacutenients

Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi

dune solution de iodomercurate

- Deacuteroulement de la technique

Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)

- aceacutetate de sodium 15 g

- acide aceacutetique cristallisable 20 ml

- formol 40 ml

-eau qsp 1000 ml

Solution B (densiteacute 140)

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 442 volumes

8 g de selles

50 ml de solution de NaCl agrave

85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min

Suspension homo

+Tamisage Examiner

Le culot

eacuteliminer

le surnageant

20 ml dune solution A

+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique

1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min

4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer

le surnageant

Examiner

Le culot

Meacutethode de seacutedimentation-flottation

pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves

- Inconveacutenients

Quand la teneur des selles en lipides est anormalement

eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de

graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique

Solution de densiteacute 135

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 520 volumes

la suspension feacutecale en

eau agrave 85 de NaCl

1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min

1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min

20 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacute

eacuteliminer

le surnageant

5 agrave 7 ml de solution diodomercurate

de potassium de densiteacute 135 20 ml deau

Examen du culot

Seacutedimentation-flottation au saccharose

pour protozoaires - Avantages

permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les

kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand

lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste

na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des

selles fixeacutees au MIF

- Inconveacutenients

Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et

flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De

plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre

que des sels de mercure sont encore utiliseacutes

-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose

saccharose 120 g

eau 200 ml

Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et

utiliser alors

saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml

Suspension homo

+Tamisage +

2 agrave 3 heures

50 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacutee

fraicircche

10 agrave 15 ml de la suspension

1800-2000 toursmin 90sec

rejeter le surnageant

L 1 en12humide

3 agrave 4 g de selles

Seacute

dim

en

tatio

n

8 agrave 10 ml de solution de saccharose

+ 05 ml de solution de chlorure

mercurique agrave 15 en ED

1000 toursmin 45 sec

deacutecanter le

surnageant

dans T2

L 2 en12humide

Flottation

T2 20 agrave 30 ml deau

2000 toursmin90 sec

L 3 en12humide

Preacutecipitation

Les colorations

utile en cas de doute lrsquoidentification des

kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces

des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires

coloreacutees

recommandeacutee pour la conservation de

mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre

laboratoire pour avis

indispensable pour le diagnostic de certains

parasites (Cryptosporides microsporides)

Meacutethodes de coloration rapides

(Colorations en tubes)

- Meacutethode de Bailenger et Faraggi

- Meacutethode de Sapro Lawless et

Strome

-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene

tamporeacute

-Meacutethode de Horkin

- Meacutethode de Sargeaut

-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero

Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de

Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-

formol Apregraves meacutelange

- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave

laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout

-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le

fond du tube

-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en

protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees

immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine

des noyaux est coloreacutee en brun par liode

Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent

donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol

sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement

leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes

- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou

directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension

de selles avec le colorant

Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des

protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux

apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs

jours

la coloration de Bailenger

Laisser pendant une nuit en contact

cristal violet 2 g

fuchsine basique 005 g

alcool agrave 95deg 20 ml

pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml

eau distilleacutee 100 ml

Coloration des frottis

Pour bien observer les structures nucleacuteaires et

garder des lames de reacutefeacuterence on

confectionne un frottis de selles humide et

eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en

- 3 temps fixation puis coloration puis

diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)

- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg

Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)

Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag

- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher

soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains

dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)

soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)

soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1

heure)

-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode

-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau

- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3

30 min agrave leacutetuve agrave 37deg

- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece

24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs

-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au

microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent

nettement

-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau

-Deacuteshydrater

-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est

poseacutee deacutefinitivement

- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les

trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure

des noyaux Les kystes apparaissent en bleu

pacircle avec des noyaux bien nets Cest une

technique facile agrave reacutealiser

- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible

- Plonger la lame dans le fixateur colorant de

Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures

- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au

baume de Canada ou au baume syntheacutetique

Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par

Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie

- Seacutechage

- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol

- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid

- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet

- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20

secondes en agitant

- Rinccedilage

-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5

- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100

- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert

Coloration des microscporidies

Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10

- Effectuer un frottis de la selle

- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de

meacutethanol

- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes

- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord

en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml

- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge

Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee

microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-

Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution

- Colorer pendant 3 heures

- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02

-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-

Rincer seacutecher et lire au grossissement x100

Coloration par Uvitex 2B

Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute

pour la chitine Met en eacutevidence les

microsporidie par une fluorescence

directe On obtient une

fluorescence bleue pale sur fond

noir

Scotch test anal ( test de Graham agrave

la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius

vermicularis ainsi que les anneaux ou les

oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors

de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est

appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant

toute toilette en position foetale ou genou

pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus

et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute

sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera

agrave lrsquoobjectif X10

NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les

parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que

la technique devra ecirctre faite avec des gants

ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite

pour eacuteviter la contamination par les oeufs

auto-infestant de lrsquooxyure

Meacutethodes speacuteciales

Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon

eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs

drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle

de la taille drsquoun petit pois

Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen

des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm

dans une quantiteacute de vert malachite agrave

3 (contre colorant) et de glyceacuterine

appliquer la bande sur la selle et sur la

lame renverser et appuyer sur la

paillasse

Methode de Kato-Katz quantitative

utilise un gabarie pour la selle

Meacutethode efficace pour la recherche

doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale

mais inutilisable pour les kytes et les

larves ainsi que les oeufs dankylostome

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

Principes theacuteoriques

-Les selles tritureacutees (meacutelange au dixiegraveme environ) dans la solution choisie - elle peut ecirctre preacutealablement passeacutee sur un tamis pour eacuteliminer les gros deacutebris

le filtrat est verseacute dans un tube agrave centrifuger agrave fond conique en le remplissant 13

deacutether de maniegravere agrave ce quil y ai 23 du meacutelange selle en laissant 1 cm pour

fermer le tube

- Lrsquoagiter pendant une minute

- La suspension eacutetheacutero-liquide obtenue est centrifugeacutee agrave une vitesse lente de

lordre de 1500 agrave 2000 toursminute pendant une agrave trois minutes

- Apregraves centrifugation les constituants de la suspension sont reacutepartis en quatre

Couches

- Deacutecoller la couche des reacutesidus lipophiles agrave laide dune baguette de verre

- Retourner le tube au dessus de leacutevier (en faisant couler de leau) ou dun bac agrave

deacutechets liquides

- Essuyer les parois du tube avec un coton tenu agrave la pince en laissant toujours le

tube avec louverture dirigeacutee vers le bas pour eacuteviter de souiller le culot avec les

reacutesidus

- Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique pour

remettre en suspension le culot qui sera examineacute

- le culot qui nous inteacuteresse qui contient les eacuteleacutement parasitaires (kystes des

protozoaires)

Ether Debris

Phase aqueuse

Le culot

Les meacutethodes diphasiques sont

-Meacutethode de Telmann 1908

-Meacutethode De Rivas 1928

-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917

-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946

-Meacutethode De Ritchie 1948

-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood

-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf

-Meacutethode De Roman 1957

-Meacutethode de Bailenger 1962-1963

-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle

-Meacutethode de Junod 1927

Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage

Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia

Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)

La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble

lors de la centrifugation ce qui est un argument

diagnostique inteacuteressant

- Inconveacutenients

Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve

restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave

deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses

- Deacuteroulement de la technique

acide aceacutetique cristallisable 5 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethode de Bailenger - Avantages

Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et

des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5

(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)

- Inconveacutenients

Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre

technique est neacutecessaire

- Deacuteroulement de la technique

aceacutetate de sodium 15 g

acide aceacutetique 36 ml

eau distilleacutee qsp 1000 ml

Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide

dun pH-megravetre

Meacutethode de Ritchie simplifieacutee

- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles

formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour

enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les

oeufs dascaris et de schistosome

- Inconveacutenients

Le culot souvent volumineux est de lecture difficile

- Deacuteroulement de la technique

- Solutions de Ritchie

eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt

eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)

Meacutethode de Blagg et al

-Avantages

-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire

les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de

liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de

mercure souille les effluents du laboratoire

- Deacuteroulement de la technique

Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou

additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est

verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation

eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes

Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)

permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute

Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et

recommencer lagitation

On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et

cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee

Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages

-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles

Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes

aiseacutement et facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de

schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue

que les techniques en un temps

- Deacuteroulement de la technique

A) NaCl 9 g

formol officinal 10 ml

eau qsp 1000 ml

B) acide citrique 100 g

formol officinal 20 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethodes combineacutees

Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et

par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande

quantiteacute de selles

Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les

rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des

formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale

- Inconveacutenients

Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez

mal - Deacuteroulement de la technique

A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml

formol officinal 100 ml

eau qsp 1 000 ml

B bromure de sodium cristalliseacute 622 g

eau distilleacutee 1000 ml

Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant

pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou

kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour

trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente

- Inconveacutenients

Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps

assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate

preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)

- Deacuteroulement de la technique

- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)

liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml

eau distilleacutee 334 ml

Concentration diphasique

(MIF ou Bailenger)

une solution de

sulfate de zinc

30 secondes agrave f v

dilueacute au quart avec ED

Examiner

Le culot

Examiner

Le culot

iodomercurate

de potassium

de densiteacute 15

dilueacute au quart avec ED

Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod

simplifieacutee) - Avantages

donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete

- Inconveacutenients

Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi

dune solution de iodomercurate

- Deacuteroulement de la technique

Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)

- aceacutetate de sodium 15 g

- acide aceacutetique cristallisable 20 ml

- formol 40 ml

-eau qsp 1000 ml

Solution B (densiteacute 140)

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 442 volumes

8 g de selles

50 ml de solution de NaCl agrave

85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min

Suspension homo

+Tamisage Examiner

Le culot

eacuteliminer

le surnageant

20 ml dune solution A

+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique

1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min

4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer

le surnageant

Examiner

Le culot

Meacutethode de seacutedimentation-flottation

pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves

- Inconveacutenients

Quand la teneur des selles en lipides est anormalement

eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de

graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique

Solution de densiteacute 135

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 520 volumes

la suspension feacutecale en

eau agrave 85 de NaCl

1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min

1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min

20 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacute

eacuteliminer

le surnageant

5 agrave 7 ml de solution diodomercurate

de potassium de densiteacute 135 20 ml deau

Examen du culot

Seacutedimentation-flottation au saccharose

pour protozoaires - Avantages

permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les

kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand

lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste

na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des

selles fixeacutees au MIF

- Inconveacutenients

Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et

flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De

plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre

que des sels de mercure sont encore utiliseacutes

-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose

saccharose 120 g

eau 200 ml

Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et

utiliser alors

saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml

Suspension homo

+Tamisage +

2 agrave 3 heures

50 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacutee

fraicircche

10 agrave 15 ml de la suspension

1800-2000 toursmin 90sec

rejeter le surnageant

L 1 en12humide

3 agrave 4 g de selles

Seacute

dim

en

tatio

n

8 agrave 10 ml de solution de saccharose

+ 05 ml de solution de chlorure

mercurique agrave 15 en ED

1000 toursmin 45 sec

deacutecanter le

surnageant

dans T2

L 2 en12humide

Flottation

T2 20 agrave 30 ml deau

2000 toursmin90 sec

L 3 en12humide

Preacutecipitation

Les colorations

utile en cas de doute lrsquoidentification des

kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces

des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires

coloreacutees

recommandeacutee pour la conservation de

mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre

laboratoire pour avis

indispensable pour le diagnostic de certains

parasites (Cryptosporides microsporides)

Meacutethodes de coloration rapides

(Colorations en tubes)

- Meacutethode de Bailenger et Faraggi

- Meacutethode de Sapro Lawless et

Strome

-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene

tamporeacute

-Meacutethode de Horkin

- Meacutethode de Sargeaut

-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero

Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de

Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-

formol Apregraves meacutelange

- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave

laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout

-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le

fond du tube

-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en

protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees

immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine

des noyaux est coloreacutee en brun par liode

Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent

donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol

sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement

leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes

- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou

directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension

de selles avec le colorant

Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des

protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux

apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs

jours

la coloration de Bailenger

Laisser pendant une nuit en contact

cristal violet 2 g

fuchsine basique 005 g

alcool agrave 95deg 20 ml

pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml

eau distilleacutee 100 ml

Coloration des frottis

Pour bien observer les structures nucleacuteaires et

garder des lames de reacutefeacuterence on

confectionne un frottis de selles humide et

eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en

- 3 temps fixation puis coloration puis

diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)

- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg

Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)

Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag

- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher

soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains

dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)

soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)

soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1

heure)

-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode

-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau

- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3

30 min agrave leacutetuve agrave 37deg

- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece

24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs

-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au

microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent

nettement

-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau

-Deacuteshydrater

-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est

poseacutee deacutefinitivement

- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les

trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure

des noyaux Les kystes apparaissent en bleu

pacircle avec des noyaux bien nets Cest une

technique facile agrave reacutealiser

- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible

- Plonger la lame dans le fixateur colorant de

Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures

- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au

baume de Canada ou au baume syntheacutetique

Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par

Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie

- Seacutechage

- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol

- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid

- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet

- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20

secondes en agitant

- Rinccedilage

-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5

- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100

- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert

Coloration des microscporidies

Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10

- Effectuer un frottis de la selle

- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de

meacutethanol

- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes

- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord

en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml

- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge

Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee

microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-

Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution

- Colorer pendant 3 heures

- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02

-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-

Rincer seacutecher et lire au grossissement x100

Coloration par Uvitex 2B

Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute

pour la chitine Met en eacutevidence les

microsporidie par une fluorescence

directe On obtient une

fluorescence bleue pale sur fond

noir

Scotch test anal ( test de Graham agrave

la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius

vermicularis ainsi que les anneaux ou les

oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors

de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est

appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant

toute toilette en position foetale ou genou

pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus

et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute

sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera

agrave lrsquoobjectif X10

NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les

parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que

la technique devra ecirctre faite avec des gants

ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite

pour eacuteviter la contamination par les oeufs

auto-infestant de lrsquooxyure

Meacutethodes speacuteciales

Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon

eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs

drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle

de la taille drsquoun petit pois

Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen

des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm

dans une quantiteacute de vert malachite agrave

3 (contre colorant) et de glyceacuterine

appliquer la bande sur la selle et sur la

lame renverser et appuyer sur la

paillasse

Methode de Kato-Katz quantitative

utilise un gabarie pour la selle

Meacutethode efficace pour la recherche

doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale

mais inutilisable pour les kytes et les

larves ainsi que les oeufs dankylostome

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

Ether Debris

Phase aqueuse

Le culot

Les meacutethodes diphasiques sont

-Meacutethode de Telmann 1908

-Meacutethode De Rivas 1928

-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917

-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946

-Meacutethode De Ritchie 1948

-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood

-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf

-Meacutethode De Roman 1957

-Meacutethode de Bailenger 1962-1963

-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle

-Meacutethode de Junod 1927

Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage

Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia

Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)

La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble

lors de la centrifugation ce qui est un argument

diagnostique inteacuteressant

- Inconveacutenients

Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve

restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave

deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses

- Deacuteroulement de la technique

acide aceacutetique cristallisable 5 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethode de Bailenger - Avantages

Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et

des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5

(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)

- Inconveacutenients

Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre

technique est neacutecessaire

- Deacuteroulement de la technique

aceacutetate de sodium 15 g

acide aceacutetique 36 ml

eau distilleacutee qsp 1000 ml

Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide

dun pH-megravetre

Meacutethode de Ritchie simplifieacutee

- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles

formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour

enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les

oeufs dascaris et de schistosome

- Inconveacutenients

Le culot souvent volumineux est de lecture difficile

- Deacuteroulement de la technique

- Solutions de Ritchie

eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt

eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)

Meacutethode de Blagg et al

-Avantages

-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire

les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de

liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de

mercure souille les effluents du laboratoire

- Deacuteroulement de la technique

Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou

additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est

verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation

eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes

Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)

permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute

Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et

recommencer lagitation

On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et

cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee

Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages

-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles

Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes

aiseacutement et facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de

schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue

que les techniques en un temps

- Deacuteroulement de la technique

A) NaCl 9 g

formol officinal 10 ml

eau qsp 1000 ml

B) acide citrique 100 g

formol officinal 20 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethodes combineacutees

Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et

par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande

quantiteacute de selles

Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les

rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des

formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale

- Inconveacutenients

Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez

mal - Deacuteroulement de la technique

A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml

formol officinal 100 ml

eau qsp 1 000 ml

B bromure de sodium cristalliseacute 622 g

eau distilleacutee 1000 ml

Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant

pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou

kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour

trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente

- Inconveacutenients

Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps

assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate

preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)

- Deacuteroulement de la technique

- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)

liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml

eau distilleacutee 334 ml

Concentration diphasique

(MIF ou Bailenger)

une solution de

sulfate de zinc

30 secondes agrave f v

dilueacute au quart avec ED

Examiner

Le culot

Examiner

Le culot

iodomercurate

de potassium

de densiteacute 15

dilueacute au quart avec ED

Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod

simplifieacutee) - Avantages

donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete

- Inconveacutenients

Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi

dune solution de iodomercurate

- Deacuteroulement de la technique

Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)

- aceacutetate de sodium 15 g

- acide aceacutetique cristallisable 20 ml

- formol 40 ml

-eau qsp 1000 ml

Solution B (densiteacute 140)

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 442 volumes

8 g de selles

50 ml de solution de NaCl agrave

85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min

Suspension homo

+Tamisage Examiner

Le culot

eacuteliminer

le surnageant

20 ml dune solution A

+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique

1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min

4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer

le surnageant

Examiner

Le culot

Meacutethode de seacutedimentation-flottation

pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves

- Inconveacutenients

Quand la teneur des selles en lipides est anormalement

eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de

graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique

Solution de densiteacute 135

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 520 volumes

la suspension feacutecale en

eau agrave 85 de NaCl

1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min

1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min

20 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacute

eacuteliminer

le surnageant

5 agrave 7 ml de solution diodomercurate

de potassium de densiteacute 135 20 ml deau

Examen du culot

Seacutedimentation-flottation au saccharose

pour protozoaires - Avantages

permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les

kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand

lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste

na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des

selles fixeacutees au MIF

- Inconveacutenients

Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et

flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De

plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre

que des sels de mercure sont encore utiliseacutes

-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose

saccharose 120 g

eau 200 ml

Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et

utiliser alors

saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml

Suspension homo

+Tamisage +

2 agrave 3 heures

50 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacutee

fraicircche

10 agrave 15 ml de la suspension

1800-2000 toursmin 90sec

rejeter le surnageant

L 1 en12humide

3 agrave 4 g de selles

Seacute

dim

en

tatio

n

8 agrave 10 ml de solution de saccharose

+ 05 ml de solution de chlorure

mercurique agrave 15 en ED

1000 toursmin 45 sec

deacutecanter le

surnageant

dans T2

L 2 en12humide

Flottation

T2 20 agrave 30 ml deau

2000 toursmin90 sec

L 3 en12humide

Preacutecipitation

Les colorations

utile en cas de doute lrsquoidentification des

kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces

des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires

coloreacutees

recommandeacutee pour la conservation de

mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre

laboratoire pour avis

indispensable pour le diagnostic de certains

parasites (Cryptosporides microsporides)

Meacutethodes de coloration rapides

(Colorations en tubes)

- Meacutethode de Bailenger et Faraggi

- Meacutethode de Sapro Lawless et

Strome

-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene

tamporeacute

-Meacutethode de Horkin

- Meacutethode de Sargeaut

-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero

Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de

Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-

formol Apregraves meacutelange

- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave

laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout

-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le

fond du tube

-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en

protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees

immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine

des noyaux est coloreacutee en brun par liode

Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent

donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol

sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement

leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes

- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou

directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension

de selles avec le colorant

Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des

protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux

apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs

jours

la coloration de Bailenger

Laisser pendant une nuit en contact

cristal violet 2 g

fuchsine basique 005 g

alcool agrave 95deg 20 ml

pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml

eau distilleacutee 100 ml

Coloration des frottis

Pour bien observer les structures nucleacuteaires et

garder des lames de reacutefeacuterence on

confectionne un frottis de selles humide et

eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en

- 3 temps fixation puis coloration puis

diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)

- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg

Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)

Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag

- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher

soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains

dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)

soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)

soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1

heure)

-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode

-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau

- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3

30 min agrave leacutetuve agrave 37deg

- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece

24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs

-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au

microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent

nettement

-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau

-Deacuteshydrater

-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est

poseacutee deacutefinitivement

- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les

trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure

des noyaux Les kystes apparaissent en bleu

pacircle avec des noyaux bien nets Cest une

technique facile agrave reacutealiser

- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible

- Plonger la lame dans le fixateur colorant de

Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures

- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au

baume de Canada ou au baume syntheacutetique

Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par

Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie

- Seacutechage

- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol

- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid

- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet

- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20

secondes en agitant

- Rinccedilage

-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5

- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100

- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert

Coloration des microscporidies

Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10

- Effectuer un frottis de la selle

- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de

meacutethanol

- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes

- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord

en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml

- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge

Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee

microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-

Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution

- Colorer pendant 3 heures

- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02

-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-

Rincer seacutecher et lire au grossissement x100

Coloration par Uvitex 2B

Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute

pour la chitine Met en eacutevidence les

microsporidie par une fluorescence

directe On obtient une

fluorescence bleue pale sur fond

noir

Scotch test anal ( test de Graham agrave

la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius

vermicularis ainsi que les anneaux ou les

oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors

de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est

appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant

toute toilette en position foetale ou genou

pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus

et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute

sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera

agrave lrsquoobjectif X10

NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les

parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que

la technique devra ecirctre faite avec des gants

ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite

pour eacuteviter la contamination par les oeufs

auto-infestant de lrsquooxyure

Meacutethodes speacuteciales

Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon

eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs

drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle

de la taille drsquoun petit pois

Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen

des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm

dans une quantiteacute de vert malachite agrave

3 (contre colorant) et de glyceacuterine

appliquer la bande sur la selle et sur la

lame renverser et appuyer sur la

paillasse

Methode de Kato-Katz quantitative

utilise un gabarie pour la selle

Meacutethode efficace pour la recherche

doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale

mais inutilisable pour les kytes et les

larves ainsi que les oeufs dankylostome

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

Les meacutethodes diphasiques sont

-Meacutethode de Telmann 1908

-Meacutethode De Rivas 1928

-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917

-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946

-Meacutethode De Ritchie 1948

-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood

-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf

-Meacutethode De Roman 1957

-Meacutethode de Bailenger 1962-1963

-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle

-Meacutethode de Junod 1927

Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage

Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia

Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)

La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble

lors de la centrifugation ce qui est un argument

diagnostique inteacuteressant

- Inconveacutenients

Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve

restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave

deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses

- Deacuteroulement de la technique

acide aceacutetique cristallisable 5 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethode de Bailenger - Avantages

Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et

des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5

(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)

- Inconveacutenients

Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre

technique est neacutecessaire

- Deacuteroulement de la technique

aceacutetate de sodium 15 g

acide aceacutetique 36 ml

eau distilleacutee qsp 1000 ml

Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide

dun pH-megravetre

Meacutethode de Ritchie simplifieacutee

- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles

formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour

enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les

oeufs dascaris et de schistosome

- Inconveacutenients

Le culot souvent volumineux est de lecture difficile

- Deacuteroulement de la technique

- Solutions de Ritchie

eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt

eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)

Meacutethode de Blagg et al

-Avantages

-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire

les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de

liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de

mercure souille les effluents du laboratoire

- Deacuteroulement de la technique

Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou

additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est

verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation

eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes

Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)

permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute

Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et

recommencer lagitation

On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et

cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee

Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages

-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles

Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes

aiseacutement et facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de

schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue

que les techniques en un temps

- Deacuteroulement de la technique

A) NaCl 9 g

formol officinal 10 ml

eau qsp 1000 ml

B) acide citrique 100 g

formol officinal 20 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethodes combineacutees

Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et

par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande

quantiteacute de selles

Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les

rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des

formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale

- Inconveacutenients

Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez

mal - Deacuteroulement de la technique

A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml

formol officinal 100 ml

eau qsp 1 000 ml

B bromure de sodium cristalliseacute 622 g

eau distilleacutee 1000 ml

Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant

pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou

kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour

trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente

- Inconveacutenients

Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps

assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate

preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)

- Deacuteroulement de la technique

- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)

liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml

eau distilleacutee 334 ml

Concentration diphasique

(MIF ou Bailenger)

une solution de

sulfate de zinc

30 secondes agrave f v

dilueacute au quart avec ED

Examiner

Le culot

Examiner

Le culot

iodomercurate

de potassium

de densiteacute 15

dilueacute au quart avec ED

Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod

simplifieacutee) - Avantages

donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete

- Inconveacutenients

Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi

dune solution de iodomercurate

- Deacuteroulement de la technique

Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)

- aceacutetate de sodium 15 g

- acide aceacutetique cristallisable 20 ml

- formol 40 ml

-eau qsp 1000 ml

Solution B (densiteacute 140)

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 442 volumes

8 g de selles

50 ml de solution de NaCl agrave

85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min

Suspension homo

+Tamisage Examiner

Le culot

eacuteliminer

le surnageant

20 ml dune solution A

+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique

1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min

4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer

le surnageant

Examiner

Le culot

Meacutethode de seacutedimentation-flottation

pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves

- Inconveacutenients

Quand la teneur des selles en lipides est anormalement

eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de

graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique

Solution de densiteacute 135

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 520 volumes

la suspension feacutecale en

eau agrave 85 de NaCl

1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min

1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min

20 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacute

eacuteliminer

le surnageant

5 agrave 7 ml de solution diodomercurate

de potassium de densiteacute 135 20 ml deau

Examen du culot

Seacutedimentation-flottation au saccharose

pour protozoaires - Avantages

permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les

kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand

lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste

na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des

selles fixeacutees au MIF

- Inconveacutenients

Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et

flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De

plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre

que des sels de mercure sont encore utiliseacutes

-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose

saccharose 120 g

eau 200 ml

Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et

utiliser alors

saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml

Suspension homo

+Tamisage +

2 agrave 3 heures

50 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacutee

fraicircche

10 agrave 15 ml de la suspension

1800-2000 toursmin 90sec

rejeter le surnageant

L 1 en12humide

3 agrave 4 g de selles

Seacute

dim

en

tatio

n

8 agrave 10 ml de solution de saccharose

+ 05 ml de solution de chlorure

mercurique agrave 15 en ED

1000 toursmin 45 sec

deacutecanter le

surnageant

dans T2

L 2 en12humide

Flottation

T2 20 agrave 30 ml deau

2000 toursmin90 sec

L 3 en12humide

Preacutecipitation

Les colorations

utile en cas de doute lrsquoidentification des

kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces

des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires

coloreacutees

recommandeacutee pour la conservation de

mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre

laboratoire pour avis

indispensable pour le diagnostic de certains

parasites (Cryptosporides microsporides)

Meacutethodes de coloration rapides

(Colorations en tubes)

- Meacutethode de Bailenger et Faraggi

- Meacutethode de Sapro Lawless et

Strome

-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene

tamporeacute

-Meacutethode de Horkin

- Meacutethode de Sargeaut

-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero

Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de

Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-

formol Apregraves meacutelange

- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave

laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout

-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le

fond du tube

-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en

protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees

immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine

des noyaux est coloreacutee en brun par liode

Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent

donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol

sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement

leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes

- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou

directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension

de selles avec le colorant

Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des

protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux

apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs

jours

la coloration de Bailenger

Laisser pendant une nuit en contact

cristal violet 2 g

fuchsine basique 005 g

alcool agrave 95deg 20 ml

pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml

eau distilleacutee 100 ml

Coloration des frottis

Pour bien observer les structures nucleacuteaires et

garder des lames de reacutefeacuterence on

confectionne un frottis de selles humide et

eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en

- 3 temps fixation puis coloration puis

diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)

- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg

Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)

Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag

- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher

soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains

dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)

soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)

soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1

heure)

-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode

-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau

- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3

30 min agrave leacutetuve agrave 37deg

- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece

24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs

-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au

microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent

nettement

-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau

-Deacuteshydrater

-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est

poseacutee deacutefinitivement

- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les

trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure

des noyaux Les kystes apparaissent en bleu

pacircle avec des noyaux bien nets Cest une

technique facile agrave reacutealiser

- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible

- Plonger la lame dans le fixateur colorant de

Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures

- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au

baume de Canada ou au baume syntheacutetique

Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par

Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie

- Seacutechage

- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol

- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid

- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet

- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20

secondes en agitant

- Rinccedilage

-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5

- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100

- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert

Coloration des microscporidies

Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10

- Effectuer un frottis de la selle

- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de

meacutethanol

- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes

- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord

en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml

- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge

Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee

microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-

Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution

- Colorer pendant 3 heures

- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02

-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-

Rincer seacutecher et lire au grossissement x100

Coloration par Uvitex 2B

Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute

pour la chitine Met en eacutevidence les

microsporidie par une fluorescence

directe On obtient une

fluorescence bleue pale sur fond

noir

Scotch test anal ( test de Graham agrave

la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius

vermicularis ainsi que les anneaux ou les

oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors

de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est

appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant

toute toilette en position foetale ou genou

pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus

et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute

sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera

agrave lrsquoobjectif X10

NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les

parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que

la technique devra ecirctre faite avec des gants

ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite

pour eacuteviter la contamination par les oeufs

auto-infestant de lrsquooxyure

Meacutethodes speacuteciales

Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon

eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs

drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle

de la taille drsquoun petit pois

Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen

des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm

dans une quantiteacute de vert malachite agrave

3 (contre colorant) et de glyceacuterine

appliquer la bande sur la selle et sur la

lame renverser et appuyer sur la

paillasse

Methode de Kato-Katz quantitative

utilise un gabarie pour la selle

Meacutethode efficace pour la recherche

doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale

mais inutilisable pour les kytes et les

larves ainsi que les oeufs dankylostome

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage

Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia

Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)

La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble

lors de la centrifugation ce qui est un argument

diagnostique inteacuteressant

- Inconveacutenients

Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve

restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave

deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses

- Deacuteroulement de la technique

acide aceacutetique cristallisable 5 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethode de Bailenger - Avantages

Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et

des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5

(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)

- Inconveacutenients

Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre

technique est neacutecessaire

- Deacuteroulement de la technique

aceacutetate de sodium 15 g

acide aceacutetique 36 ml

eau distilleacutee qsp 1000 ml

Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide

dun pH-megravetre

Meacutethode de Ritchie simplifieacutee

- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles

formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour

enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les

oeufs dascaris et de schistosome

- Inconveacutenients

Le culot souvent volumineux est de lecture difficile

- Deacuteroulement de la technique

- Solutions de Ritchie

eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt

eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)

Meacutethode de Blagg et al

-Avantages

-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire

les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de

liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de

mercure souille les effluents du laboratoire

- Deacuteroulement de la technique

Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou

additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est

verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation

eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes

Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)

permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute

Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et

recommencer lagitation

On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et

cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee

Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages

-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles

Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes

aiseacutement et facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de

schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue

que les techniques en un temps

- Deacuteroulement de la technique

A) NaCl 9 g

formol officinal 10 ml

eau qsp 1000 ml

B) acide citrique 100 g

formol officinal 20 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethodes combineacutees

Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et

par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande

quantiteacute de selles

Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les

rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des

formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale

- Inconveacutenients

Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez

mal - Deacuteroulement de la technique

A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml

formol officinal 100 ml

eau qsp 1 000 ml

B bromure de sodium cristalliseacute 622 g

eau distilleacutee 1000 ml

Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant

pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou

kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour

trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente

- Inconveacutenients

Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps

assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate

preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)

- Deacuteroulement de la technique

- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)

liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml

eau distilleacutee 334 ml

Concentration diphasique

(MIF ou Bailenger)

une solution de

sulfate de zinc

30 secondes agrave f v

dilueacute au quart avec ED

Examiner

Le culot

Examiner

Le culot

iodomercurate

de potassium

de densiteacute 15

dilueacute au quart avec ED

Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod

simplifieacutee) - Avantages

donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete

- Inconveacutenients

Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi

dune solution de iodomercurate

- Deacuteroulement de la technique

Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)

- aceacutetate de sodium 15 g

- acide aceacutetique cristallisable 20 ml

- formol 40 ml

-eau qsp 1000 ml

Solution B (densiteacute 140)

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 442 volumes

8 g de selles

50 ml de solution de NaCl agrave

85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min

Suspension homo

+Tamisage Examiner

Le culot

eacuteliminer

le surnageant

20 ml dune solution A

+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique

1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min

4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer

le surnageant

Examiner

Le culot

Meacutethode de seacutedimentation-flottation

pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves

- Inconveacutenients

Quand la teneur des selles en lipides est anormalement

eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de

graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique

Solution de densiteacute 135

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 520 volumes

la suspension feacutecale en

eau agrave 85 de NaCl

1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min

1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min

20 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacute

eacuteliminer

le surnageant

5 agrave 7 ml de solution diodomercurate

de potassium de densiteacute 135 20 ml deau

Examen du culot

Seacutedimentation-flottation au saccharose

pour protozoaires - Avantages

permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les

kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand

lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste

na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des

selles fixeacutees au MIF

- Inconveacutenients

Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et

flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De

plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre

que des sels de mercure sont encore utiliseacutes

-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose

saccharose 120 g

eau 200 ml

Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et

utiliser alors

saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml

Suspension homo

+Tamisage +

2 agrave 3 heures

50 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacutee

fraicircche

10 agrave 15 ml de la suspension

1800-2000 toursmin 90sec

rejeter le surnageant

L 1 en12humide

3 agrave 4 g de selles

Seacute

dim

en

tatio

n

8 agrave 10 ml de solution de saccharose

+ 05 ml de solution de chlorure

mercurique agrave 15 en ED

1000 toursmin 45 sec

deacutecanter le

surnageant

dans T2

L 2 en12humide

Flottation

T2 20 agrave 30 ml deau

2000 toursmin90 sec

L 3 en12humide

Preacutecipitation

Les colorations

utile en cas de doute lrsquoidentification des

kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces

des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires

coloreacutees

recommandeacutee pour la conservation de

mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre

laboratoire pour avis

indispensable pour le diagnostic de certains

parasites (Cryptosporides microsporides)

Meacutethodes de coloration rapides

(Colorations en tubes)

- Meacutethode de Bailenger et Faraggi

- Meacutethode de Sapro Lawless et

Strome

-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene

tamporeacute

-Meacutethode de Horkin

- Meacutethode de Sargeaut

-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero

Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de

Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-

formol Apregraves meacutelange

- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave

laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout

-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le

fond du tube

-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en

protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees

immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine

des noyaux est coloreacutee en brun par liode

Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent

donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol

sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement

leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes

- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou

directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension

de selles avec le colorant

Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des

protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux

apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs

jours

la coloration de Bailenger

Laisser pendant une nuit en contact

cristal violet 2 g

fuchsine basique 005 g

alcool agrave 95deg 20 ml

pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml

eau distilleacutee 100 ml

Coloration des frottis

Pour bien observer les structures nucleacuteaires et

garder des lames de reacutefeacuterence on

confectionne un frottis de selles humide et

eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en

- 3 temps fixation puis coloration puis

diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)

- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg

Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)

Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag

- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher

soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains

dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)

soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)

soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1

heure)

-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode

-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau

- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3

30 min agrave leacutetuve agrave 37deg

- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece

24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs

-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au

microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent

nettement

-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau

-Deacuteshydrater

-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est

poseacutee deacutefinitivement

- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les

trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure

des noyaux Les kystes apparaissent en bleu

pacircle avec des noyaux bien nets Cest une

technique facile agrave reacutealiser

- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible

- Plonger la lame dans le fixateur colorant de

Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures

- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au

baume de Canada ou au baume syntheacutetique

Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par

Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie

- Seacutechage

- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol

- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid

- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet

- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20

secondes en agitant

- Rinccedilage

-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5

- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100

- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert

Coloration des microscporidies

Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10

- Effectuer un frottis de la selle

- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de

meacutethanol

- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes

- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord

en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml

- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge

Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee

microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-

Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution

- Colorer pendant 3 heures

- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02

-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-

Rincer seacutecher et lire au grossissement x100

Coloration par Uvitex 2B

Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute

pour la chitine Met en eacutevidence les

microsporidie par une fluorescence

directe On obtient une

fluorescence bleue pale sur fond

noir

Scotch test anal ( test de Graham agrave

la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius

vermicularis ainsi que les anneaux ou les

oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors

de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est

appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant

toute toilette en position foetale ou genou

pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus

et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute

sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera

agrave lrsquoobjectif X10

NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les

parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que

la technique devra ecirctre faite avec des gants

ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite

pour eacuteviter la contamination par les oeufs

auto-infestant de lrsquooxyure

Meacutethodes speacuteciales

Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon

eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs

drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle

de la taille drsquoun petit pois

Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen

des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm

dans une quantiteacute de vert malachite agrave

3 (contre colorant) et de glyceacuterine

appliquer la bande sur la selle et sur la

lame renverser et appuyer sur la

paillasse

Methode de Kato-Katz quantitative

utilise un gabarie pour la selle

Meacutethode efficace pour la recherche

doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale

mais inutilisable pour les kytes et les

larves ainsi que les oeufs dankylostome

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

Meacutethode de Bailenger - Avantages

Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et

des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5

(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)

- Inconveacutenients

Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre

technique est neacutecessaire

- Deacuteroulement de la technique

aceacutetate de sodium 15 g

acide aceacutetique 36 ml

eau distilleacutee qsp 1000 ml

Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide

dun pH-megravetre

Meacutethode de Ritchie simplifieacutee

- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles

formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour

enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les

oeufs dascaris et de schistosome

- Inconveacutenients

Le culot souvent volumineux est de lecture difficile

- Deacuteroulement de la technique

- Solutions de Ritchie

eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt

eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)

Meacutethode de Blagg et al

-Avantages

-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire

les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de

liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de

mercure souille les effluents du laboratoire

- Deacuteroulement de la technique

Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou

additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est

verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation

eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes

Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)

permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute

Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et

recommencer lagitation

On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et

cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee

Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages

-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles

Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes

aiseacutement et facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de

schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue

que les techniques en un temps

- Deacuteroulement de la technique

A) NaCl 9 g

formol officinal 10 ml

eau qsp 1000 ml

B) acide citrique 100 g

formol officinal 20 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethodes combineacutees

Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et

par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande

quantiteacute de selles

Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les

rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des

formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale

- Inconveacutenients

Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez

mal - Deacuteroulement de la technique

A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml

formol officinal 100 ml

eau qsp 1 000 ml

B bromure de sodium cristalliseacute 622 g

eau distilleacutee 1000 ml

Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant

pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou

kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour

trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente

- Inconveacutenients

Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps

assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate

preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)

- Deacuteroulement de la technique

- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)

liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml

eau distilleacutee 334 ml

Concentration diphasique

(MIF ou Bailenger)

une solution de

sulfate de zinc

30 secondes agrave f v

dilueacute au quart avec ED

Examiner

Le culot

Examiner

Le culot

iodomercurate

de potassium

de densiteacute 15

dilueacute au quart avec ED

Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod

simplifieacutee) - Avantages

donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete

- Inconveacutenients

Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi

dune solution de iodomercurate

- Deacuteroulement de la technique

Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)

- aceacutetate de sodium 15 g

- acide aceacutetique cristallisable 20 ml

- formol 40 ml

-eau qsp 1000 ml

Solution B (densiteacute 140)

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 442 volumes

8 g de selles

50 ml de solution de NaCl agrave

85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min

Suspension homo

+Tamisage Examiner

Le culot

eacuteliminer

le surnageant

20 ml dune solution A

+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique

1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min

4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer

le surnageant

Examiner

Le culot

Meacutethode de seacutedimentation-flottation

pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves

- Inconveacutenients

Quand la teneur des selles en lipides est anormalement

eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de

graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique

Solution de densiteacute 135

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 520 volumes

la suspension feacutecale en

eau agrave 85 de NaCl

1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min

1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min

20 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacute

eacuteliminer

le surnageant

5 agrave 7 ml de solution diodomercurate

de potassium de densiteacute 135 20 ml deau

Examen du culot

Seacutedimentation-flottation au saccharose

pour protozoaires - Avantages

permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les

kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand

lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste

na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des

selles fixeacutees au MIF

- Inconveacutenients

Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et

flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De

plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre

que des sels de mercure sont encore utiliseacutes

-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose

saccharose 120 g

eau 200 ml

Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et

utiliser alors

saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml

Suspension homo

+Tamisage +

2 agrave 3 heures

50 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacutee

fraicircche

10 agrave 15 ml de la suspension

1800-2000 toursmin 90sec

rejeter le surnageant

L 1 en12humide

3 agrave 4 g de selles

Seacute

dim

en

tatio

n

8 agrave 10 ml de solution de saccharose

+ 05 ml de solution de chlorure

mercurique agrave 15 en ED

1000 toursmin 45 sec

deacutecanter le

surnageant

dans T2

L 2 en12humide

Flottation

T2 20 agrave 30 ml deau

2000 toursmin90 sec

L 3 en12humide

Preacutecipitation

Les colorations

utile en cas de doute lrsquoidentification des

kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces

des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires

coloreacutees

recommandeacutee pour la conservation de

mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre

laboratoire pour avis

indispensable pour le diagnostic de certains

parasites (Cryptosporides microsporides)

Meacutethodes de coloration rapides

(Colorations en tubes)

- Meacutethode de Bailenger et Faraggi

- Meacutethode de Sapro Lawless et

Strome

-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene

tamporeacute

-Meacutethode de Horkin

- Meacutethode de Sargeaut

-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero

Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de

Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-

formol Apregraves meacutelange

- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave

laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout

-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le

fond du tube

-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en

protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees

immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine

des noyaux est coloreacutee en brun par liode

Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent

donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol

sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement

leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes

- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou

directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension

de selles avec le colorant

Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des

protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux

apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs

jours

la coloration de Bailenger

Laisser pendant une nuit en contact

cristal violet 2 g

fuchsine basique 005 g

alcool agrave 95deg 20 ml

pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml

eau distilleacutee 100 ml

Coloration des frottis

Pour bien observer les structures nucleacuteaires et

garder des lames de reacutefeacuterence on

confectionne un frottis de selles humide et

eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en

- 3 temps fixation puis coloration puis

diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)

- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg

Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)

Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag

- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher

soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains

dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)

soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)

soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1

heure)

-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode

-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau

- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3

30 min agrave leacutetuve agrave 37deg

- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece

24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs

-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au

microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent

nettement

-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau

-Deacuteshydrater

-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est

poseacutee deacutefinitivement

- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les

trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure

des noyaux Les kystes apparaissent en bleu

pacircle avec des noyaux bien nets Cest une

technique facile agrave reacutealiser

- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible

- Plonger la lame dans le fixateur colorant de

Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures

- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au

baume de Canada ou au baume syntheacutetique

Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par

Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie

- Seacutechage

- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol

- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid

- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet

- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20

secondes en agitant

- Rinccedilage

-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5

- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100

- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert

Coloration des microscporidies

Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10

- Effectuer un frottis de la selle

- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de

meacutethanol

- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes

- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord

en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml

- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge

Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee

microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-

Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution

- Colorer pendant 3 heures

- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02

-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-

Rincer seacutecher et lire au grossissement x100

Coloration par Uvitex 2B

Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute

pour la chitine Met en eacutevidence les

microsporidie par une fluorescence

directe On obtient une

fluorescence bleue pale sur fond

noir

Scotch test anal ( test de Graham agrave

la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius

vermicularis ainsi que les anneaux ou les

oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors

de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est

appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant

toute toilette en position foetale ou genou

pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus

et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute

sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera

agrave lrsquoobjectif X10

NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les

parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que

la technique devra ecirctre faite avec des gants

ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite

pour eacuteviter la contamination par les oeufs

auto-infestant de lrsquooxyure

Meacutethodes speacuteciales

Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon

eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs

drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle

de la taille drsquoun petit pois

Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen

des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm

dans une quantiteacute de vert malachite agrave

3 (contre colorant) et de glyceacuterine

appliquer la bande sur la selle et sur la

lame renverser et appuyer sur la

paillasse

Methode de Kato-Katz quantitative

utilise un gabarie pour la selle

Meacutethode efficace pour la recherche

doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale

mais inutilisable pour les kytes et les

larves ainsi que les oeufs dankylostome

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

Meacutethode de Ritchie simplifieacutee

- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles

formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour

enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les

oeufs dascaris et de schistosome

- Inconveacutenients

Le culot souvent volumineux est de lecture difficile

- Deacuteroulement de la technique

- Solutions de Ritchie

eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt

eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)

Meacutethode de Blagg et al

-Avantages

-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire

les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de

liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de

mercure souille les effluents du laboratoire

- Deacuteroulement de la technique

Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou

additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est

verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation

eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes

Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)

permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute

Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et

recommencer lagitation

On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et

cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee

Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages

-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles

Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes

aiseacutement et facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de

schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue

que les techniques en un temps

- Deacuteroulement de la technique

A) NaCl 9 g

formol officinal 10 ml

eau qsp 1000 ml

B) acide citrique 100 g

formol officinal 20 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethodes combineacutees

Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et

par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande

quantiteacute de selles

Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les

rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des

formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale

- Inconveacutenients

Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez

mal - Deacuteroulement de la technique

A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml

formol officinal 100 ml

eau qsp 1 000 ml

B bromure de sodium cristalliseacute 622 g

eau distilleacutee 1000 ml

Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant

pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou

kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour

trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente

- Inconveacutenients

Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps

assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate

preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)

- Deacuteroulement de la technique

- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)

liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml

eau distilleacutee 334 ml

Concentration diphasique

(MIF ou Bailenger)

une solution de

sulfate de zinc

30 secondes agrave f v

dilueacute au quart avec ED

Examiner

Le culot

Examiner

Le culot

iodomercurate

de potassium

de densiteacute 15

dilueacute au quart avec ED

Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod

simplifieacutee) - Avantages

donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete

- Inconveacutenients

Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi

dune solution de iodomercurate

- Deacuteroulement de la technique

Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)

- aceacutetate de sodium 15 g

- acide aceacutetique cristallisable 20 ml

- formol 40 ml

-eau qsp 1000 ml

Solution B (densiteacute 140)

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 442 volumes

8 g de selles

50 ml de solution de NaCl agrave

85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min

Suspension homo

+Tamisage Examiner

Le culot

eacuteliminer

le surnageant

20 ml dune solution A

+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique

1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min

4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer

le surnageant

Examiner

Le culot

Meacutethode de seacutedimentation-flottation

pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves

- Inconveacutenients

Quand la teneur des selles en lipides est anormalement

eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de

graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique

Solution de densiteacute 135

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 520 volumes

la suspension feacutecale en

eau agrave 85 de NaCl

1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min

1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min

20 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacute

eacuteliminer

le surnageant

5 agrave 7 ml de solution diodomercurate

de potassium de densiteacute 135 20 ml deau

Examen du culot

Seacutedimentation-flottation au saccharose

pour protozoaires - Avantages

permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les

kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand

lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste

na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des

selles fixeacutees au MIF

- Inconveacutenients

Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et

flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De

plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre

que des sels de mercure sont encore utiliseacutes

-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose

saccharose 120 g

eau 200 ml

Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et

utiliser alors

saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml

Suspension homo

+Tamisage +

2 agrave 3 heures

50 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacutee

fraicircche

10 agrave 15 ml de la suspension

1800-2000 toursmin 90sec

rejeter le surnageant

L 1 en12humide

3 agrave 4 g de selles

Seacute

dim

en

tatio

n

8 agrave 10 ml de solution de saccharose

+ 05 ml de solution de chlorure

mercurique agrave 15 en ED

1000 toursmin 45 sec

deacutecanter le

surnageant

dans T2

L 2 en12humide

Flottation

T2 20 agrave 30 ml deau

2000 toursmin90 sec

L 3 en12humide

Preacutecipitation

Les colorations

utile en cas de doute lrsquoidentification des

kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces

des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires

coloreacutees

recommandeacutee pour la conservation de

mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre

laboratoire pour avis

indispensable pour le diagnostic de certains

parasites (Cryptosporides microsporides)

Meacutethodes de coloration rapides

(Colorations en tubes)

- Meacutethode de Bailenger et Faraggi

- Meacutethode de Sapro Lawless et

Strome

-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene

tamporeacute

-Meacutethode de Horkin

- Meacutethode de Sargeaut

-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero

Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de

Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-

formol Apregraves meacutelange

- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave

laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout

-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le

fond du tube

-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en

protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees

immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine

des noyaux est coloreacutee en brun par liode

Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent

donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol

sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement

leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes

- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou

directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension

de selles avec le colorant

Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des

protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux

apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs

jours

la coloration de Bailenger

Laisser pendant une nuit en contact

cristal violet 2 g

fuchsine basique 005 g

alcool agrave 95deg 20 ml

pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml

eau distilleacutee 100 ml

Coloration des frottis

Pour bien observer les structures nucleacuteaires et

garder des lames de reacutefeacuterence on

confectionne un frottis de selles humide et

eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en

- 3 temps fixation puis coloration puis

diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)

- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg

Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)

Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag

- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher

soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains

dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)

soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)

soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1

heure)

-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode

-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau

- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3

30 min agrave leacutetuve agrave 37deg

- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece

24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs

-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au

microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent

nettement

-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau

-Deacuteshydrater

-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est

poseacutee deacutefinitivement

- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les

trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure

des noyaux Les kystes apparaissent en bleu

pacircle avec des noyaux bien nets Cest une

technique facile agrave reacutealiser

- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible

- Plonger la lame dans le fixateur colorant de

Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures

- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au

baume de Canada ou au baume syntheacutetique

Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par

Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie

- Seacutechage

- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol

- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid

- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet

- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20

secondes en agitant

- Rinccedilage

-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5

- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100

- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert

Coloration des microscporidies

Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10

- Effectuer un frottis de la selle

- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de

meacutethanol

- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes

- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord

en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml

- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge

Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee

microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-

Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution

- Colorer pendant 3 heures

- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02

-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-

Rincer seacutecher et lire au grossissement x100

Coloration par Uvitex 2B

Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute

pour la chitine Met en eacutevidence les

microsporidie par une fluorescence

directe On obtient une

fluorescence bleue pale sur fond

noir

Scotch test anal ( test de Graham agrave

la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius

vermicularis ainsi que les anneaux ou les

oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors

de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est

appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant

toute toilette en position foetale ou genou

pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus

et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute

sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera

agrave lrsquoobjectif X10

NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les

parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que

la technique devra ecirctre faite avec des gants

ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite

pour eacuteviter la contamination par les oeufs

auto-infestant de lrsquooxyure

Meacutethodes speacuteciales

Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon

eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs

drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle

de la taille drsquoun petit pois

Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen

des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm

dans une quantiteacute de vert malachite agrave

3 (contre colorant) et de glyceacuterine

appliquer la bande sur la selle et sur la

lame renverser et appuyer sur la

paillasse

Methode de Kato-Katz quantitative

utilise un gabarie pour la selle

Meacutethode efficace pour la recherche

doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale

mais inutilisable pour les kytes et les

larves ainsi que les oeufs dankylostome

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

Meacutethode de Blagg et al

-Avantages

-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire

les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de

liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de

mercure souille les effluents du laboratoire

- Deacuteroulement de la technique

Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou

additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est

verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation

eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes

Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)

permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute

Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et

recommencer lagitation

On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et

cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee

Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages

-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles

Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes

aiseacutement et facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de

schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue

que les techniques en un temps

- Deacuteroulement de la technique

A) NaCl 9 g

formol officinal 10 ml

eau qsp 1000 ml

B) acide citrique 100 g

formol officinal 20 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethodes combineacutees

Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et

par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande

quantiteacute de selles

Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les

rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des

formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale

- Inconveacutenients

Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez

mal - Deacuteroulement de la technique

A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml

formol officinal 100 ml

eau qsp 1 000 ml

B bromure de sodium cristalliseacute 622 g

eau distilleacutee 1000 ml

Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant

pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou

kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour

trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente

- Inconveacutenients

Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps

assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate

preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)

- Deacuteroulement de la technique

- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)

liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml

eau distilleacutee 334 ml

Concentration diphasique

(MIF ou Bailenger)

une solution de

sulfate de zinc

30 secondes agrave f v

dilueacute au quart avec ED

Examiner

Le culot

Examiner

Le culot

iodomercurate

de potassium

de densiteacute 15

dilueacute au quart avec ED

Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod

simplifieacutee) - Avantages

donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete

- Inconveacutenients

Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi

dune solution de iodomercurate

- Deacuteroulement de la technique

Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)

- aceacutetate de sodium 15 g

- acide aceacutetique cristallisable 20 ml

- formol 40 ml

-eau qsp 1000 ml

Solution B (densiteacute 140)

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 442 volumes

8 g de selles

50 ml de solution de NaCl agrave

85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min

Suspension homo

+Tamisage Examiner

Le culot

eacuteliminer

le surnageant

20 ml dune solution A

+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique

1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min

4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer

le surnageant

Examiner

Le culot

Meacutethode de seacutedimentation-flottation

pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves

- Inconveacutenients

Quand la teneur des selles en lipides est anormalement

eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de

graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique

Solution de densiteacute 135

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 520 volumes

la suspension feacutecale en

eau agrave 85 de NaCl

1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min

1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min

20 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacute

eacuteliminer

le surnageant

5 agrave 7 ml de solution diodomercurate

de potassium de densiteacute 135 20 ml deau

Examen du culot

Seacutedimentation-flottation au saccharose

pour protozoaires - Avantages

permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les

kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand

lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste

na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des

selles fixeacutees au MIF

- Inconveacutenients

Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et

flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De

plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre

que des sels de mercure sont encore utiliseacutes

-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose

saccharose 120 g

eau 200 ml

Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et

utiliser alors

saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml

Suspension homo

+Tamisage +

2 agrave 3 heures

50 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacutee

fraicircche

10 agrave 15 ml de la suspension

1800-2000 toursmin 90sec

rejeter le surnageant

L 1 en12humide

3 agrave 4 g de selles

Seacute

dim

en

tatio

n

8 agrave 10 ml de solution de saccharose

+ 05 ml de solution de chlorure

mercurique agrave 15 en ED

1000 toursmin 45 sec

deacutecanter le

surnageant

dans T2

L 2 en12humide

Flottation

T2 20 agrave 30 ml deau

2000 toursmin90 sec

L 3 en12humide

Preacutecipitation

Les colorations

utile en cas de doute lrsquoidentification des

kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces

des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires

coloreacutees

recommandeacutee pour la conservation de

mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre

laboratoire pour avis

indispensable pour le diagnostic de certains

parasites (Cryptosporides microsporides)

Meacutethodes de coloration rapides

(Colorations en tubes)

- Meacutethode de Bailenger et Faraggi

- Meacutethode de Sapro Lawless et

Strome

-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene

tamporeacute

-Meacutethode de Horkin

- Meacutethode de Sargeaut

-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero

Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de

Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-

formol Apregraves meacutelange

- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave

laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout

-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le

fond du tube

-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en

protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees

immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine

des noyaux est coloreacutee en brun par liode

Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent

donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol

sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement

leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes

- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou

directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension

de selles avec le colorant

Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des

protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux

apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs

jours

la coloration de Bailenger

Laisser pendant une nuit en contact

cristal violet 2 g

fuchsine basique 005 g

alcool agrave 95deg 20 ml

pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml

eau distilleacutee 100 ml

Coloration des frottis

Pour bien observer les structures nucleacuteaires et

garder des lames de reacutefeacuterence on

confectionne un frottis de selles humide et

eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en

- 3 temps fixation puis coloration puis

diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)

- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg

Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)

Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag

- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher

soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains

dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)

soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)

soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1

heure)

-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode

-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau

- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3

30 min agrave leacutetuve agrave 37deg

- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece

24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs

-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au

microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent

nettement

-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau

-Deacuteshydrater

-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est

poseacutee deacutefinitivement

- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les

trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure

des noyaux Les kystes apparaissent en bleu

pacircle avec des noyaux bien nets Cest une

technique facile agrave reacutealiser

- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible

- Plonger la lame dans le fixateur colorant de

Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures

- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au

baume de Canada ou au baume syntheacutetique

Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par

Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie

- Seacutechage

- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol

- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid

- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet

- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20

secondes en agitant

- Rinccedilage

-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5

- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100

- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert

Coloration des microscporidies

Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10

- Effectuer un frottis de la selle

- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de

meacutethanol

- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes

- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord

en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml

- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge

Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee

microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-

Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution

- Colorer pendant 3 heures

- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02

-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-

Rincer seacutecher et lire au grossissement x100

Coloration par Uvitex 2B

Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute

pour la chitine Met en eacutevidence les

microsporidie par une fluorescence

directe On obtient une

fluorescence bleue pale sur fond

noir

Scotch test anal ( test de Graham agrave

la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius

vermicularis ainsi que les anneaux ou les

oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors

de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est

appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant

toute toilette en position foetale ou genou

pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus

et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute

sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera

agrave lrsquoobjectif X10

NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les

parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que

la technique devra ecirctre faite avec des gants

ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite

pour eacuteviter la contamination par les oeufs

auto-infestant de lrsquooxyure

Meacutethodes speacuteciales

Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon

eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs

drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle

de la taille drsquoun petit pois

Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen

des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm

dans une quantiteacute de vert malachite agrave

3 (contre colorant) et de glyceacuterine

appliquer la bande sur la selle et sur la

lame renverser et appuyer sur la

paillasse

Methode de Kato-Katz quantitative

utilise un gabarie pour la selle

Meacutethode efficace pour la recherche

doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale

mais inutilisable pour les kytes et les

larves ainsi que les oeufs dankylostome

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages

-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles

Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes

aiseacutement et facilement identifiables

- Inconveacutenients

Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de

schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue

que les techniques en un temps

- Deacuteroulement de la technique

A) NaCl 9 g

formol officinal 10 ml

eau qsp 1000 ml

B) acide citrique 100 g

formol officinal 20 ml

eau qsp 1000 ml

Meacutethodes combineacutees

Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et

par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande

quantiteacute de selles

Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les

rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des

formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale

- Inconveacutenients

Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez

mal - Deacuteroulement de la technique

A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml

formol officinal 100 ml

eau qsp 1 000 ml

B bromure de sodium cristalliseacute 622 g

eau distilleacutee 1000 ml

Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant

pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou

kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour

trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente

- Inconveacutenients

Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps

assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate

preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)

- Deacuteroulement de la technique

- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)

liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml

eau distilleacutee 334 ml

Concentration diphasique

(MIF ou Bailenger)

une solution de

sulfate de zinc

30 secondes agrave f v

dilueacute au quart avec ED

Examiner

Le culot

Examiner

Le culot

iodomercurate

de potassium

de densiteacute 15

dilueacute au quart avec ED

Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod

simplifieacutee) - Avantages

donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete

- Inconveacutenients

Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi

dune solution de iodomercurate

- Deacuteroulement de la technique

Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)

- aceacutetate de sodium 15 g

- acide aceacutetique cristallisable 20 ml

- formol 40 ml

-eau qsp 1000 ml

Solution B (densiteacute 140)

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 442 volumes

8 g de selles

50 ml de solution de NaCl agrave

85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min

Suspension homo

+Tamisage Examiner

Le culot

eacuteliminer

le surnageant

20 ml dune solution A

+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique

1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min

4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer

le surnageant

Examiner

Le culot

Meacutethode de seacutedimentation-flottation

pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves

- Inconveacutenients

Quand la teneur des selles en lipides est anormalement

eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de

graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique

Solution de densiteacute 135

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 520 volumes

la suspension feacutecale en

eau agrave 85 de NaCl

1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min

1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min

20 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacute

eacuteliminer

le surnageant

5 agrave 7 ml de solution diodomercurate

de potassium de densiteacute 135 20 ml deau

Examen du culot

Seacutedimentation-flottation au saccharose

pour protozoaires - Avantages

permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les

kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand

lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste

na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des

selles fixeacutees au MIF

- Inconveacutenients

Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et

flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De

plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre

que des sels de mercure sont encore utiliseacutes

-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose

saccharose 120 g

eau 200 ml

Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et

utiliser alors

saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml

Suspension homo

+Tamisage +

2 agrave 3 heures

50 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacutee

fraicircche

10 agrave 15 ml de la suspension

1800-2000 toursmin 90sec

rejeter le surnageant

L 1 en12humide

3 agrave 4 g de selles

Seacute

dim

en

tatio

n

8 agrave 10 ml de solution de saccharose

+ 05 ml de solution de chlorure

mercurique agrave 15 en ED

1000 toursmin 45 sec

deacutecanter le

surnageant

dans T2

L 2 en12humide

Flottation

T2 20 agrave 30 ml deau

2000 toursmin90 sec

L 3 en12humide

Preacutecipitation

Les colorations

utile en cas de doute lrsquoidentification des

kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces

des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires

coloreacutees

recommandeacutee pour la conservation de

mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre

laboratoire pour avis

indispensable pour le diagnostic de certains

parasites (Cryptosporides microsporides)

Meacutethodes de coloration rapides

(Colorations en tubes)

- Meacutethode de Bailenger et Faraggi

- Meacutethode de Sapro Lawless et

Strome

-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene

tamporeacute

-Meacutethode de Horkin

- Meacutethode de Sargeaut

-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero

Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de

Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-

formol Apregraves meacutelange

- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave

laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout

-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le

fond du tube

-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en

protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees

immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine

des noyaux est coloreacutee en brun par liode

Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent

donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol

sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement

leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes

- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou

directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension

de selles avec le colorant

Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des

protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux

apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs

jours

la coloration de Bailenger

Laisser pendant une nuit en contact

cristal violet 2 g

fuchsine basique 005 g

alcool agrave 95deg 20 ml

pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml

eau distilleacutee 100 ml

Coloration des frottis

Pour bien observer les structures nucleacuteaires et

garder des lames de reacutefeacuterence on

confectionne un frottis de selles humide et

eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en

- 3 temps fixation puis coloration puis

diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)

- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg

Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)

Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag

- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher

soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains

dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)

soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)

soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1

heure)

-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode

-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau

- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3

30 min agrave leacutetuve agrave 37deg

- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece

24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs

-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au

microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent

nettement

-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau

-Deacuteshydrater

-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est

poseacutee deacutefinitivement

- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les

trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure

des noyaux Les kystes apparaissent en bleu

pacircle avec des noyaux bien nets Cest une

technique facile agrave reacutealiser

- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible

- Plonger la lame dans le fixateur colorant de

Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures

- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au

baume de Canada ou au baume syntheacutetique

Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par

Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie

- Seacutechage

- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol

- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid

- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet

- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20

secondes en agitant

- Rinccedilage

-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5

- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100

- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert

Coloration des microscporidies

Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10

- Effectuer un frottis de la selle

- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de

meacutethanol

- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes

- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord

en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml

- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge

Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee

microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-

Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution

- Colorer pendant 3 heures

- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02

-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-

Rincer seacutecher et lire au grossissement x100

Coloration par Uvitex 2B

Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute

pour la chitine Met en eacutevidence les

microsporidie par une fluorescence

directe On obtient une

fluorescence bleue pale sur fond

noir

Scotch test anal ( test de Graham agrave

la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius

vermicularis ainsi que les anneaux ou les

oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors

de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est

appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant

toute toilette en position foetale ou genou

pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus

et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute

sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera

agrave lrsquoobjectif X10

NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les

parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que

la technique devra ecirctre faite avec des gants

ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite

pour eacuteviter la contamination par les oeufs

auto-infestant de lrsquooxyure

Meacutethodes speacuteciales

Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon

eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs

drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle

de la taille drsquoun petit pois

Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen

des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm

dans une quantiteacute de vert malachite agrave

3 (contre colorant) et de glyceacuterine

appliquer la bande sur la selle et sur la

lame renverser et appuyer sur la

paillasse

Methode de Kato-Katz quantitative

utilise un gabarie pour la selle

Meacutethode efficace pour la recherche

doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale

mais inutilisable pour les kytes et les

larves ainsi que les oeufs dankylostome

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et

par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande

quantiteacute de selles

Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les

rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des

formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale

- Inconveacutenients

Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez

mal - Deacuteroulement de la technique

A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml

formol officinal 100 ml

eau qsp 1 000 ml

B bromure de sodium cristalliseacute 622 g

eau distilleacutee 1000 ml

Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant

pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou

kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour

trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente

- Inconveacutenients

Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps

assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate

preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)

- Deacuteroulement de la technique

- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)

liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml

eau distilleacutee 334 ml

Concentration diphasique

(MIF ou Bailenger)

une solution de

sulfate de zinc

30 secondes agrave f v

dilueacute au quart avec ED

Examiner

Le culot

Examiner

Le culot

iodomercurate

de potassium

de densiteacute 15

dilueacute au quart avec ED

Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod

simplifieacutee) - Avantages

donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete

- Inconveacutenients

Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi

dune solution de iodomercurate

- Deacuteroulement de la technique

Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)

- aceacutetate de sodium 15 g

- acide aceacutetique cristallisable 20 ml

- formol 40 ml

-eau qsp 1000 ml

Solution B (densiteacute 140)

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 442 volumes

8 g de selles

50 ml de solution de NaCl agrave

85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min

Suspension homo

+Tamisage Examiner

Le culot

eacuteliminer

le surnageant

20 ml dune solution A

+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique

1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min

4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer

le surnageant

Examiner

Le culot

Meacutethode de seacutedimentation-flottation

pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves

- Inconveacutenients

Quand la teneur des selles en lipides est anormalement

eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de

graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique

Solution de densiteacute 135

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 520 volumes

la suspension feacutecale en

eau agrave 85 de NaCl

1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min

1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min

20 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacute

eacuteliminer

le surnageant

5 agrave 7 ml de solution diodomercurate

de potassium de densiteacute 135 20 ml deau

Examen du culot

Seacutedimentation-flottation au saccharose

pour protozoaires - Avantages

permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les

kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand

lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste

na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des

selles fixeacutees au MIF

- Inconveacutenients

Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et

flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De

plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre

que des sels de mercure sont encore utiliseacutes

-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose

saccharose 120 g

eau 200 ml

Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et

utiliser alors

saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml

Suspension homo

+Tamisage +

2 agrave 3 heures

50 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacutee

fraicircche

10 agrave 15 ml de la suspension

1800-2000 toursmin 90sec

rejeter le surnageant

L 1 en12humide

3 agrave 4 g de selles

Seacute

dim

en

tatio

n

8 agrave 10 ml de solution de saccharose

+ 05 ml de solution de chlorure

mercurique agrave 15 en ED

1000 toursmin 45 sec

deacutecanter le

surnageant

dans T2

L 2 en12humide

Flottation

T2 20 agrave 30 ml deau

2000 toursmin90 sec

L 3 en12humide

Preacutecipitation

Les colorations

utile en cas de doute lrsquoidentification des

kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces

des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires

coloreacutees

recommandeacutee pour la conservation de

mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre

laboratoire pour avis

indispensable pour le diagnostic de certains

parasites (Cryptosporides microsporides)

Meacutethodes de coloration rapides

(Colorations en tubes)

- Meacutethode de Bailenger et Faraggi

- Meacutethode de Sapro Lawless et

Strome

-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene

tamporeacute

-Meacutethode de Horkin

- Meacutethode de Sargeaut

-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero

Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de

Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-

formol Apregraves meacutelange

- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave

laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout

-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le

fond du tube

-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en

protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees

immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine

des noyaux est coloreacutee en brun par liode

Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent

donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol

sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement

leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes

- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou

directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension

de selles avec le colorant

Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des

protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux

apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs

jours

la coloration de Bailenger

Laisser pendant une nuit en contact

cristal violet 2 g

fuchsine basique 005 g

alcool agrave 95deg 20 ml

pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml

eau distilleacutee 100 ml

Coloration des frottis

Pour bien observer les structures nucleacuteaires et

garder des lames de reacutefeacuterence on

confectionne un frottis de selles humide et

eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en

- 3 temps fixation puis coloration puis

diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)

- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg

Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)

Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag

- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher

soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains

dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)

soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)

soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1

heure)

-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode

-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau

- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3

30 min agrave leacutetuve agrave 37deg

- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece

24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs

-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au

microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent

nettement

-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau

-Deacuteshydrater

-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est

poseacutee deacutefinitivement

- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les

trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure

des noyaux Les kystes apparaissent en bleu

pacircle avec des noyaux bien nets Cest une

technique facile agrave reacutealiser

- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible

- Plonger la lame dans le fixateur colorant de

Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures

- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au

baume de Canada ou au baume syntheacutetique

Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par

Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie

- Seacutechage

- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol

- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid

- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet

- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20

secondes en agitant

- Rinccedilage

-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5

- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100

- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert

Coloration des microscporidies

Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10

- Effectuer un frottis de la selle

- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de

meacutethanol

- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes

- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord

en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml

- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge

Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee

microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-

Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution

- Colorer pendant 3 heures

- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02

-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-

Rincer seacutecher et lire au grossissement x100

Coloration par Uvitex 2B

Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute

pour la chitine Met en eacutevidence les

microsporidie par une fluorescence

directe On obtient une

fluorescence bleue pale sur fond

noir

Scotch test anal ( test de Graham agrave

la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius

vermicularis ainsi que les anneaux ou les

oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors

de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est

appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant

toute toilette en position foetale ou genou

pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus

et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute

sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera

agrave lrsquoobjectif X10

NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les

parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que

la technique devra ecirctre faite avec des gants

ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite

pour eacuteviter la contamination par les oeufs

auto-infestant de lrsquooxyure

Meacutethodes speacuteciales

Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon

eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs

drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle

de la taille drsquoun petit pois

Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen

des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm

dans une quantiteacute de vert malachite agrave

3 (contre colorant) et de glyceacuterine

appliquer la bande sur la selle et sur la

lame renverser et appuyer sur la

paillasse

Methode de Kato-Katz quantitative

utilise un gabarie pour la selle

Meacutethode efficace pour la recherche

doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale

mais inutilisable pour les kytes et les

larves ainsi que les oeufs dankylostome

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant

pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou

kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour

trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente

- Inconveacutenients

Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps

assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate

preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)

- Deacuteroulement de la technique

- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)

liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml

eau distilleacutee 334 ml

Concentration diphasique

(MIF ou Bailenger)

une solution de

sulfate de zinc

30 secondes agrave f v

dilueacute au quart avec ED

Examiner

Le culot

Examiner

Le culot

iodomercurate

de potassium

de densiteacute 15

dilueacute au quart avec ED

Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod

simplifieacutee) - Avantages

donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete

- Inconveacutenients

Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi

dune solution de iodomercurate

- Deacuteroulement de la technique

Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)

- aceacutetate de sodium 15 g

- acide aceacutetique cristallisable 20 ml

- formol 40 ml

-eau qsp 1000 ml

Solution B (densiteacute 140)

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 442 volumes

8 g de selles

50 ml de solution de NaCl agrave

85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min

Suspension homo

+Tamisage Examiner

Le culot

eacuteliminer

le surnageant

20 ml dune solution A

+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique

1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min

4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer

le surnageant

Examiner

Le culot

Meacutethode de seacutedimentation-flottation

pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves

- Inconveacutenients

Quand la teneur des selles en lipides est anormalement

eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de

graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique

Solution de densiteacute 135

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 520 volumes

la suspension feacutecale en

eau agrave 85 de NaCl

1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min

1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min

20 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacute

eacuteliminer

le surnageant

5 agrave 7 ml de solution diodomercurate

de potassium de densiteacute 135 20 ml deau

Examen du culot

Seacutedimentation-flottation au saccharose

pour protozoaires - Avantages

permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les

kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand

lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste

na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des

selles fixeacutees au MIF

- Inconveacutenients

Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et

flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De

plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre

que des sels de mercure sont encore utiliseacutes

-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose

saccharose 120 g

eau 200 ml

Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et

utiliser alors

saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml

Suspension homo

+Tamisage +

2 agrave 3 heures

50 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacutee

fraicircche

10 agrave 15 ml de la suspension

1800-2000 toursmin 90sec

rejeter le surnageant

L 1 en12humide

3 agrave 4 g de selles

Seacute

dim

en

tatio

n

8 agrave 10 ml de solution de saccharose

+ 05 ml de solution de chlorure

mercurique agrave 15 en ED

1000 toursmin 45 sec

deacutecanter le

surnageant

dans T2

L 2 en12humide

Flottation

T2 20 agrave 30 ml deau

2000 toursmin90 sec

L 3 en12humide

Preacutecipitation

Les colorations

utile en cas de doute lrsquoidentification des

kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces

des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires

coloreacutees

recommandeacutee pour la conservation de

mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre

laboratoire pour avis

indispensable pour le diagnostic de certains

parasites (Cryptosporides microsporides)

Meacutethodes de coloration rapides

(Colorations en tubes)

- Meacutethode de Bailenger et Faraggi

- Meacutethode de Sapro Lawless et

Strome

-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene

tamporeacute

-Meacutethode de Horkin

- Meacutethode de Sargeaut

-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero

Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de

Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-

formol Apregraves meacutelange

- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave

laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout

-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le

fond du tube

-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en

protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees

immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine

des noyaux est coloreacutee en brun par liode

Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent

donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol

sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement

leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes

- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou

directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension

de selles avec le colorant

Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des

protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux

apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs

jours

la coloration de Bailenger

Laisser pendant une nuit en contact

cristal violet 2 g

fuchsine basique 005 g

alcool agrave 95deg 20 ml

pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml

eau distilleacutee 100 ml

Coloration des frottis

Pour bien observer les structures nucleacuteaires et

garder des lames de reacutefeacuterence on

confectionne un frottis de selles humide et

eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en

- 3 temps fixation puis coloration puis

diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)

- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg

Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)

Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag

- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher

soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains

dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)

soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)

soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1

heure)

-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode

-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau

- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3

30 min agrave leacutetuve agrave 37deg

- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece

24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs

-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au

microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent

nettement

-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau

-Deacuteshydrater

-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est

poseacutee deacutefinitivement

- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les

trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure

des noyaux Les kystes apparaissent en bleu

pacircle avec des noyaux bien nets Cest une

technique facile agrave reacutealiser

- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible

- Plonger la lame dans le fixateur colorant de

Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures

- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au

baume de Canada ou au baume syntheacutetique

Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par

Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie

- Seacutechage

- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol

- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid

- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet

- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20

secondes en agitant

- Rinccedilage

-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5

- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100

- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert

Coloration des microscporidies

Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10

- Effectuer un frottis de la selle

- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de

meacutethanol

- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes

- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord

en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml

- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge

Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee

microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-

Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution

- Colorer pendant 3 heures

- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02

-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-

Rincer seacutecher et lire au grossissement x100

Coloration par Uvitex 2B

Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute

pour la chitine Met en eacutevidence les

microsporidie par une fluorescence

directe On obtient une

fluorescence bleue pale sur fond

noir

Scotch test anal ( test de Graham agrave

la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius

vermicularis ainsi que les anneaux ou les

oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors

de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est

appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant

toute toilette en position foetale ou genou

pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus

et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute

sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera

agrave lrsquoobjectif X10

NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les

parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que

la technique devra ecirctre faite avec des gants

ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite

pour eacuteviter la contamination par les oeufs

auto-infestant de lrsquooxyure

Meacutethodes speacuteciales

Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon

eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs

drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle

de la taille drsquoun petit pois

Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen

des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm

dans une quantiteacute de vert malachite agrave

3 (contre colorant) et de glyceacuterine

appliquer la bande sur la selle et sur la

lame renverser et appuyer sur la

paillasse

Methode de Kato-Katz quantitative

utilise un gabarie pour la selle

Meacutethode efficace pour la recherche

doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale

mais inutilisable pour les kytes et les

larves ainsi que les oeufs dankylostome

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

Concentration diphasique

(MIF ou Bailenger)

une solution de

sulfate de zinc

30 secondes agrave f v

dilueacute au quart avec ED

Examiner

Le culot

Examiner

Le culot

iodomercurate

de potassium

de densiteacute 15

dilueacute au quart avec ED

Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod

simplifieacutee) - Avantages

donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete

- Inconveacutenients

Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi

dune solution de iodomercurate

- Deacuteroulement de la technique

Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)

- aceacutetate de sodium 15 g

- acide aceacutetique cristallisable 20 ml

- formol 40 ml

-eau qsp 1000 ml

Solution B (densiteacute 140)

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 442 volumes

8 g de selles

50 ml de solution de NaCl agrave

85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min

Suspension homo

+Tamisage Examiner

Le culot

eacuteliminer

le surnageant

20 ml dune solution A

+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique

1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min

4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer

le surnageant

Examiner

Le culot

Meacutethode de seacutedimentation-flottation

pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves

- Inconveacutenients

Quand la teneur des selles en lipides est anormalement

eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de

graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique

Solution de densiteacute 135

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 520 volumes

la suspension feacutecale en

eau agrave 85 de NaCl

1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min

1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min

20 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacute

eacuteliminer

le surnageant

5 agrave 7 ml de solution diodomercurate

de potassium de densiteacute 135 20 ml deau

Examen du culot

Seacutedimentation-flottation au saccharose

pour protozoaires - Avantages

permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les

kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand

lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste

na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des

selles fixeacutees au MIF

- Inconveacutenients

Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et

flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De

plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre

que des sels de mercure sont encore utiliseacutes

-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose

saccharose 120 g

eau 200 ml

Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et

utiliser alors

saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml

Suspension homo

+Tamisage +

2 agrave 3 heures

50 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacutee

fraicircche

10 agrave 15 ml de la suspension

1800-2000 toursmin 90sec

rejeter le surnageant

L 1 en12humide

3 agrave 4 g de selles

Seacute

dim

en

tatio

n

8 agrave 10 ml de solution de saccharose

+ 05 ml de solution de chlorure

mercurique agrave 15 en ED

1000 toursmin 45 sec

deacutecanter le

surnageant

dans T2

L 2 en12humide

Flottation

T2 20 agrave 30 ml deau

2000 toursmin90 sec

L 3 en12humide

Preacutecipitation

Les colorations

utile en cas de doute lrsquoidentification des

kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces

des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires

coloreacutees

recommandeacutee pour la conservation de

mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre

laboratoire pour avis

indispensable pour le diagnostic de certains

parasites (Cryptosporides microsporides)

Meacutethodes de coloration rapides

(Colorations en tubes)

- Meacutethode de Bailenger et Faraggi

- Meacutethode de Sapro Lawless et

Strome

-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene

tamporeacute

-Meacutethode de Horkin

- Meacutethode de Sargeaut

-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero

Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de

Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-

formol Apregraves meacutelange

- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave

laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout

-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le

fond du tube

-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en

protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees

immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine

des noyaux est coloreacutee en brun par liode

Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent

donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol

sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement

leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes

- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou

directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension

de selles avec le colorant

Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des

protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux

apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs

jours

la coloration de Bailenger

Laisser pendant une nuit en contact

cristal violet 2 g

fuchsine basique 005 g

alcool agrave 95deg 20 ml

pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml

eau distilleacutee 100 ml

Coloration des frottis

Pour bien observer les structures nucleacuteaires et

garder des lames de reacutefeacuterence on

confectionne un frottis de selles humide et

eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en

- 3 temps fixation puis coloration puis

diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)

- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg

Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)

Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag

- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher

soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains

dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)

soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)

soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1

heure)

-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode

-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau

- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3

30 min agrave leacutetuve agrave 37deg

- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece

24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs

-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au

microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent

nettement

-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau

-Deacuteshydrater

-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est

poseacutee deacutefinitivement

- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les

trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure

des noyaux Les kystes apparaissent en bleu

pacircle avec des noyaux bien nets Cest une

technique facile agrave reacutealiser

- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible

- Plonger la lame dans le fixateur colorant de

Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures

- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au

baume de Canada ou au baume syntheacutetique

Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par

Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie

- Seacutechage

- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol

- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid

- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet

- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20

secondes en agitant

- Rinccedilage

-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5

- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100

- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert

Coloration des microscporidies

Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10

- Effectuer un frottis de la selle

- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de

meacutethanol

- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes

- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord

en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml

- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge

Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee

microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-

Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution

- Colorer pendant 3 heures

- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02

-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-

Rincer seacutecher et lire au grossissement x100

Coloration par Uvitex 2B

Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute

pour la chitine Met en eacutevidence les

microsporidie par une fluorescence

directe On obtient une

fluorescence bleue pale sur fond

noir

Scotch test anal ( test de Graham agrave

la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius

vermicularis ainsi que les anneaux ou les

oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors

de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est

appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant

toute toilette en position foetale ou genou

pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus

et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute

sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera

agrave lrsquoobjectif X10

NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les

parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que

la technique devra ecirctre faite avec des gants

ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite

pour eacuteviter la contamination par les oeufs

auto-infestant de lrsquooxyure

Meacutethodes speacuteciales

Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon

eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs

drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle

de la taille drsquoun petit pois

Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen

des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm

dans une quantiteacute de vert malachite agrave

3 (contre colorant) et de glyceacuterine

appliquer la bande sur la selle et sur la

lame renverser et appuyer sur la

paillasse

Methode de Kato-Katz quantitative

utilise un gabarie pour la selle

Meacutethode efficace pour la recherche

doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale

mais inutilisable pour les kytes et les

larves ainsi que les oeufs dankylostome

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod

simplifieacutee) - Avantages

donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete

- Inconveacutenients

Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi

dune solution de iodomercurate

- Deacuteroulement de la technique

Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)

- aceacutetate de sodium 15 g

- acide aceacutetique cristallisable 20 ml

- formol 40 ml

-eau qsp 1000 ml

Solution B (densiteacute 140)

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 442 volumes

8 g de selles

50 ml de solution de NaCl agrave

85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min

Suspension homo

+Tamisage Examiner

Le culot

eacuteliminer

le surnageant

20 ml dune solution A

+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique

1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min

4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer

le surnageant

Examiner

Le culot

Meacutethode de seacutedimentation-flottation

pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves

- Inconveacutenients

Quand la teneur des selles en lipides est anormalement

eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de

graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique

Solution de densiteacute 135

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 520 volumes

la suspension feacutecale en

eau agrave 85 de NaCl

1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min

1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min

20 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacute

eacuteliminer

le surnageant

5 agrave 7 ml de solution diodomercurate

de potassium de densiteacute 135 20 ml deau

Examen du culot

Seacutedimentation-flottation au saccharose

pour protozoaires - Avantages

permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les

kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand

lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste

na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des

selles fixeacutees au MIF

- Inconveacutenients

Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et

flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De

plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre

que des sels de mercure sont encore utiliseacutes

-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose

saccharose 120 g

eau 200 ml

Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et

utiliser alors

saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml

Suspension homo

+Tamisage +

2 agrave 3 heures

50 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacutee

fraicircche

10 agrave 15 ml de la suspension

1800-2000 toursmin 90sec

rejeter le surnageant

L 1 en12humide

3 agrave 4 g de selles

Seacute

dim

en

tatio

n

8 agrave 10 ml de solution de saccharose

+ 05 ml de solution de chlorure

mercurique agrave 15 en ED

1000 toursmin 45 sec

deacutecanter le

surnageant

dans T2

L 2 en12humide

Flottation

T2 20 agrave 30 ml deau

2000 toursmin90 sec

L 3 en12humide

Preacutecipitation

Les colorations

utile en cas de doute lrsquoidentification des

kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces

des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires

coloreacutees

recommandeacutee pour la conservation de

mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre

laboratoire pour avis

indispensable pour le diagnostic de certains

parasites (Cryptosporides microsporides)

Meacutethodes de coloration rapides

(Colorations en tubes)

- Meacutethode de Bailenger et Faraggi

- Meacutethode de Sapro Lawless et

Strome

-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene

tamporeacute

-Meacutethode de Horkin

- Meacutethode de Sargeaut

-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero

Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de

Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-

formol Apregraves meacutelange

- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave

laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout

-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le

fond du tube

-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en

protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees

immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine

des noyaux est coloreacutee en brun par liode

Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent

donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol

sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement

leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes

- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou

directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension

de selles avec le colorant

Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des

protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux

apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs

jours

la coloration de Bailenger

Laisser pendant une nuit en contact

cristal violet 2 g

fuchsine basique 005 g

alcool agrave 95deg 20 ml

pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml

eau distilleacutee 100 ml

Coloration des frottis

Pour bien observer les structures nucleacuteaires et

garder des lames de reacutefeacuterence on

confectionne un frottis de selles humide et

eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en

- 3 temps fixation puis coloration puis

diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)

- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg

Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)

Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag

- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher

soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains

dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)

soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)

soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1

heure)

-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode

-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau

- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3

30 min agrave leacutetuve agrave 37deg

- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece

24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs

-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au

microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent

nettement

-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau

-Deacuteshydrater

-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est

poseacutee deacutefinitivement

- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les

trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure

des noyaux Les kystes apparaissent en bleu

pacircle avec des noyaux bien nets Cest une

technique facile agrave reacutealiser

- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible

- Plonger la lame dans le fixateur colorant de

Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures

- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au

baume de Canada ou au baume syntheacutetique

Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par

Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie

- Seacutechage

- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol

- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid

- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet

- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20

secondes en agitant

- Rinccedilage

-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5

- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100

- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert

Coloration des microscporidies

Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10

- Effectuer un frottis de la selle

- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de

meacutethanol

- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes

- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord

en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml

- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge

Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee

microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-

Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution

- Colorer pendant 3 heures

- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02

-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-

Rincer seacutecher et lire au grossissement x100

Coloration par Uvitex 2B

Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute

pour la chitine Met en eacutevidence les

microsporidie par une fluorescence

directe On obtient une

fluorescence bleue pale sur fond

noir

Scotch test anal ( test de Graham agrave

la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius

vermicularis ainsi que les anneaux ou les

oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors

de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est

appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant

toute toilette en position foetale ou genou

pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus

et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute

sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera

agrave lrsquoobjectif X10

NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les

parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que

la technique devra ecirctre faite avec des gants

ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite

pour eacuteviter la contamination par les oeufs

auto-infestant de lrsquooxyure

Meacutethodes speacuteciales

Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon

eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs

drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle

de la taille drsquoun petit pois

Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen

des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm

dans une quantiteacute de vert malachite agrave

3 (contre colorant) et de glyceacuterine

appliquer la bande sur la selle et sur la

lame renverser et appuyer sur la

paillasse

Methode de Kato-Katz quantitative

utilise un gabarie pour la selle

Meacutethode efficace pour la recherche

doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale

mais inutilisable pour les kytes et les

larves ainsi que les oeufs dankylostome

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

8 g de selles

50 ml de solution de NaCl agrave

85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min

Suspension homo

+Tamisage Examiner

Le culot

eacuteliminer

le surnageant

20 ml dune solution A

+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique

1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min

4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer

le surnageant

Examiner

Le culot

Meacutethode de seacutedimentation-flottation

pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves

- Inconveacutenients

Quand la teneur des selles en lipides est anormalement

eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de

graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique

Solution de densiteacute 135

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 520 volumes

la suspension feacutecale en

eau agrave 85 de NaCl

1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min

1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min

20 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacute

eacuteliminer

le surnageant

5 agrave 7 ml de solution diodomercurate

de potassium de densiteacute 135 20 ml deau

Examen du culot

Seacutedimentation-flottation au saccharose

pour protozoaires - Avantages

permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les

kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand

lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste

na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des

selles fixeacutees au MIF

- Inconveacutenients

Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et

flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De

plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre

que des sels de mercure sont encore utiliseacutes

-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose

saccharose 120 g

eau 200 ml

Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et

utiliser alors

saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml

Suspension homo

+Tamisage +

2 agrave 3 heures

50 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacutee

fraicircche

10 agrave 15 ml de la suspension

1800-2000 toursmin 90sec

rejeter le surnageant

L 1 en12humide

3 agrave 4 g de selles

Seacute

dim

en

tatio

n

8 agrave 10 ml de solution de saccharose

+ 05 ml de solution de chlorure

mercurique agrave 15 en ED

1000 toursmin 45 sec

deacutecanter le

surnageant

dans T2

L 2 en12humide

Flottation

T2 20 agrave 30 ml deau

2000 toursmin90 sec

L 3 en12humide

Preacutecipitation

Les colorations

utile en cas de doute lrsquoidentification des

kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces

des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires

coloreacutees

recommandeacutee pour la conservation de

mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre

laboratoire pour avis

indispensable pour le diagnostic de certains

parasites (Cryptosporides microsporides)

Meacutethodes de coloration rapides

(Colorations en tubes)

- Meacutethode de Bailenger et Faraggi

- Meacutethode de Sapro Lawless et

Strome

-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene

tamporeacute

-Meacutethode de Horkin

- Meacutethode de Sargeaut

-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero

Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de

Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-

formol Apregraves meacutelange

- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave

laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout

-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le

fond du tube

-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en

protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees

immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine

des noyaux est coloreacutee en brun par liode

Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent

donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol

sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement

leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes

- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou

directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension

de selles avec le colorant

Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des

protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux

apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs

jours

la coloration de Bailenger

Laisser pendant une nuit en contact

cristal violet 2 g

fuchsine basique 005 g

alcool agrave 95deg 20 ml

pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml

eau distilleacutee 100 ml

Coloration des frottis

Pour bien observer les structures nucleacuteaires et

garder des lames de reacutefeacuterence on

confectionne un frottis de selles humide et

eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en

- 3 temps fixation puis coloration puis

diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)

- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg

Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)

Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag

- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher

soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains

dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)

soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)

soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1

heure)

-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode

-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau

- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3

30 min agrave leacutetuve agrave 37deg

- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece

24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs

-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au

microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent

nettement

-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau

-Deacuteshydrater

-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est

poseacutee deacutefinitivement

- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les

trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure

des noyaux Les kystes apparaissent en bleu

pacircle avec des noyaux bien nets Cest une

technique facile agrave reacutealiser

- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible

- Plonger la lame dans le fixateur colorant de

Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures

- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au

baume de Canada ou au baume syntheacutetique

Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par

Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie

- Seacutechage

- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol

- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid

- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet

- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20

secondes en agitant

- Rinccedilage

-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5

- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100

- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert

Coloration des microscporidies

Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10

- Effectuer un frottis de la selle

- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de

meacutethanol

- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes

- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord

en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml

- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge

Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee

microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-

Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution

- Colorer pendant 3 heures

- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02

-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-

Rincer seacutecher et lire au grossissement x100

Coloration par Uvitex 2B

Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute

pour la chitine Met en eacutevidence les

microsporidie par une fluorescence

directe On obtient une

fluorescence bleue pale sur fond

noir

Scotch test anal ( test de Graham agrave

la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius

vermicularis ainsi que les anneaux ou les

oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors

de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est

appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant

toute toilette en position foetale ou genou

pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus

et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute

sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera

agrave lrsquoobjectif X10

NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les

parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que

la technique devra ecirctre faite avec des gants

ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite

pour eacuteviter la contamination par les oeufs

auto-infestant de lrsquooxyure

Meacutethodes speacuteciales

Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon

eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs

drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle

de la taille drsquoun petit pois

Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen

des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm

dans une quantiteacute de vert malachite agrave

3 (contre colorant) et de glyceacuterine

appliquer la bande sur la selle et sur la

lame renverser et appuyer sur la

paillasse

Methode de Kato-Katz quantitative

utilise un gabarie pour la selle

Meacutethode efficace pour la recherche

doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale

mais inutilisable pour les kytes et les

larves ainsi que les oeufs dankylostome

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

Meacutethode de seacutedimentation-flottation

pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves

- Inconveacutenients

Quand la teneur des selles en lipides est anormalement

eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de

graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique

Solution de densiteacute 135

- liqueur de Thoulet 1 volume

- eau 520 volumes

la suspension feacutecale en

eau agrave 85 de NaCl

1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min

1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min

20 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacute

eacuteliminer

le surnageant

5 agrave 7 ml de solution diodomercurate

de potassium de densiteacute 135 20 ml deau

Examen du culot

Seacutedimentation-flottation au saccharose

pour protozoaires - Avantages

permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les

kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand

lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste

na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des

selles fixeacutees au MIF

- Inconveacutenients

Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et

flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De

plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre

que des sels de mercure sont encore utiliseacutes

-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose

saccharose 120 g

eau 200 ml

Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et

utiliser alors

saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml

Suspension homo

+Tamisage +

2 agrave 3 heures

50 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacutee

fraicircche

10 agrave 15 ml de la suspension

1800-2000 toursmin 90sec

rejeter le surnageant

L 1 en12humide

3 agrave 4 g de selles

Seacute

dim

en

tatio

n

8 agrave 10 ml de solution de saccharose

+ 05 ml de solution de chlorure

mercurique agrave 15 en ED

1000 toursmin 45 sec

deacutecanter le

surnageant

dans T2

L 2 en12humide

Flottation

T2 20 agrave 30 ml deau

2000 toursmin90 sec

L 3 en12humide

Preacutecipitation

Les colorations

utile en cas de doute lrsquoidentification des

kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces

des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires

coloreacutees

recommandeacutee pour la conservation de

mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre

laboratoire pour avis

indispensable pour le diagnostic de certains

parasites (Cryptosporides microsporides)

Meacutethodes de coloration rapides

(Colorations en tubes)

- Meacutethode de Bailenger et Faraggi

- Meacutethode de Sapro Lawless et

Strome

-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene

tamporeacute

-Meacutethode de Horkin

- Meacutethode de Sargeaut

-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero

Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de

Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-

formol Apregraves meacutelange

- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave

laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout

-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le

fond du tube

-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en

protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees

immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine

des noyaux est coloreacutee en brun par liode

Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent

donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol

sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement

leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes

- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou

directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension

de selles avec le colorant

Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des

protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux

apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs

jours

la coloration de Bailenger

Laisser pendant une nuit en contact

cristal violet 2 g

fuchsine basique 005 g

alcool agrave 95deg 20 ml

pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml

eau distilleacutee 100 ml

Coloration des frottis

Pour bien observer les structures nucleacuteaires et

garder des lames de reacutefeacuterence on

confectionne un frottis de selles humide et

eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en

- 3 temps fixation puis coloration puis

diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)

- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg

Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)

Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag

- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher

soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains

dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)

soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)

soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1

heure)

-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode

-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau

- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3

30 min agrave leacutetuve agrave 37deg

- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece

24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs

-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au

microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent

nettement

-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau

-Deacuteshydrater

-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est

poseacutee deacutefinitivement

- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les

trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure

des noyaux Les kystes apparaissent en bleu

pacircle avec des noyaux bien nets Cest une

technique facile agrave reacutealiser

- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible

- Plonger la lame dans le fixateur colorant de

Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures

- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au

baume de Canada ou au baume syntheacutetique

Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par

Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie

- Seacutechage

- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol

- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid

- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet

- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20

secondes en agitant

- Rinccedilage

-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5

- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100

- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert

Coloration des microscporidies

Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10

- Effectuer un frottis de la selle

- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de

meacutethanol

- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes

- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord

en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml

- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge

Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee

microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-

Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution

- Colorer pendant 3 heures

- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02

-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-

Rincer seacutecher et lire au grossissement x100

Coloration par Uvitex 2B

Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute

pour la chitine Met en eacutevidence les

microsporidie par une fluorescence

directe On obtient une

fluorescence bleue pale sur fond

noir

Scotch test anal ( test de Graham agrave

la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius

vermicularis ainsi que les anneaux ou les

oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors

de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est

appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant

toute toilette en position foetale ou genou

pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus

et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute

sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera

agrave lrsquoobjectif X10

NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les

parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que

la technique devra ecirctre faite avec des gants

ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite

pour eacuteviter la contamination par les oeufs

auto-infestant de lrsquooxyure

Meacutethodes speacuteciales

Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon

eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs

drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle

de la taille drsquoun petit pois

Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen

des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm

dans une quantiteacute de vert malachite agrave

3 (contre colorant) et de glyceacuterine

appliquer la bande sur la selle et sur la

lame renverser et appuyer sur la

paillasse

Methode de Kato-Katz quantitative

utilise un gabarie pour la selle

Meacutethode efficace pour la recherche

doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale

mais inutilisable pour les kytes et les

larves ainsi que les oeufs dankylostome

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

la suspension feacutecale en

eau agrave 85 de NaCl

1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min

1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min

20 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacute

eacuteliminer

le surnageant

5 agrave 7 ml de solution diodomercurate

de potassium de densiteacute 135 20 ml deau

Examen du culot

Seacutedimentation-flottation au saccharose

pour protozoaires - Avantages

permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les

kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand

lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste

na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des

selles fixeacutees au MIF

- Inconveacutenients

Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et

flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De

plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre

que des sels de mercure sont encore utiliseacutes

-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose

saccharose 120 g

eau 200 ml

Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et

utiliser alors

saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml

Suspension homo

+Tamisage +

2 agrave 3 heures

50 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacutee

fraicircche

10 agrave 15 ml de la suspension

1800-2000 toursmin 90sec

rejeter le surnageant

L 1 en12humide

3 agrave 4 g de selles

Seacute

dim

en

tatio

n

8 agrave 10 ml de solution de saccharose

+ 05 ml de solution de chlorure

mercurique agrave 15 en ED

1000 toursmin 45 sec

deacutecanter le

surnageant

dans T2

L 2 en12humide

Flottation

T2 20 agrave 30 ml deau

2000 toursmin90 sec

L 3 en12humide

Preacutecipitation

Les colorations

utile en cas de doute lrsquoidentification des

kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces

des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires

coloreacutees

recommandeacutee pour la conservation de

mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre

laboratoire pour avis

indispensable pour le diagnostic de certains

parasites (Cryptosporides microsporides)

Meacutethodes de coloration rapides

(Colorations en tubes)

- Meacutethode de Bailenger et Faraggi

- Meacutethode de Sapro Lawless et

Strome

-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene

tamporeacute

-Meacutethode de Horkin

- Meacutethode de Sargeaut

-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero

Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de

Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-

formol Apregraves meacutelange

- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave

laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout

-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le

fond du tube

-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en

protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees

immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine

des noyaux est coloreacutee en brun par liode

Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent

donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol

sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement

leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes

- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou

directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension

de selles avec le colorant

Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des

protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux

apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs

jours

la coloration de Bailenger

Laisser pendant une nuit en contact

cristal violet 2 g

fuchsine basique 005 g

alcool agrave 95deg 20 ml

pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml

eau distilleacutee 100 ml

Coloration des frottis

Pour bien observer les structures nucleacuteaires et

garder des lames de reacutefeacuterence on

confectionne un frottis de selles humide et

eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en

- 3 temps fixation puis coloration puis

diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)

- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg

Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)

Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag

- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher

soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains

dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)

soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)

soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1

heure)

-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode

-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau

- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3

30 min agrave leacutetuve agrave 37deg

- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece

24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs

-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au

microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent

nettement

-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau

-Deacuteshydrater

-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est

poseacutee deacutefinitivement

- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les

trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure

des noyaux Les kystes apparaissent en bleu

pacircle avec des noyaux bien nets Cest une

technique facile agrave reacutealiser

- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible

- Plonger la lame dans le fixateur colorant de

Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures

- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au

baume de Canada ou au baume syntheacutetique

Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par

Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie

- Seacutechage

- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol

- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid

- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet

- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20

secondes en agitant

- Rinccedilage

-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5

- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100

- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert

Coloration des microscporidies

Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10

- Effectuer un frottis de la selle

- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de

meacutethanol

- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes

- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord

en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml

- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge

Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee

microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-

Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution

- Colorer pendant 3 heures

- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02

-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-

Rincer seacutecher et lire au grossissement x100

Coloration par Uvitex 2B

Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute

pour la chitine Met en eacutevidence les

microsporidie par une fluorescence

directe On obtient une

fluorescence bleue pale sur fond

noir

Scotch test anal ( test de Graham agrave

la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius

vermicularis ainsi que les anneaux ou les

oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors

de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est

appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant

toute toilette en position foetale ou genou

pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus

et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute

sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera

agrave lrsquoobjectif X10

NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les

parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que

la technique devra ecirctre faite avec des gants

ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite

pour eacuteviter la contamination par les oeufs

auto-infestant de lrsquooxyure

Meacutethodes speacuteciales

Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon

eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs

drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle

de la taille drsquoun petit pois

Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen

des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm

dans une quantiteacute de vert malachite agrave

3 (contre colorant) et de glyceacuterine

appliquer la bande sur la selle et sur la

lame renverser et appuyer sur la

paillasse

Methode de Kato-Katz quantitative

utilise un gabarie pour la selle

Meacutethode efficace pour la recherche

doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale

mais inutilisable pour les kytes et les

larves ainsi que les oeufs dankylostome

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

Seacutedimentation-flottation au saccharose

pour protozoaires - Avantages

permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les

kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand

lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste

na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des

selles fixeacutees au MIF

- Inconveacutenients

Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et

flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De

plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre

que des sels de mercure sont encore utiliseacutes

-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose

saccharose 120 g

eau 200 ml

Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et

utiliser alors

saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml

Suspension homo

+Tamisage +

2 agrave 3 heures

50 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacutee

fraicircche

10 agrave 15 ml de la suspension

1800-2000 toursmin 90sec

rejeter le surnageant

L 1 en12humide

3 agrave 4 g de selles

Seacute

dim

en

tatio

n

8 agrave 10 ml de solution de saccharose

+ 05 ml de solution de chlorure

mercurique agrave 15 en ED

1000 toursmin 45 sec

deacutecanter le

surnageant

dans T2

L 2 en12humide

Flottation

T2 20 agrave 30 ml deau

2000 toursmin90 sec

L 3 en12humide

Preacutecipitation

Les colorations

utile en cas de doute lrsquoidentification des

kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces

des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires

coloreacutees

recommandeacutee pour la conservation de

mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre

laboratoire pour avis

indispensable pour le diagnostic de certains

parasites (Cryptosporides microsporides)

Meacutethodes de coloration rapides

(Colorations en tubes)

- Meacutethode de Bailenger et Faraggi

- Meacutethode de Sapro Lawless et

Strome

-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene

tamporeacute

-Meacutethode de Horkin

- Meacutethode de Sargeaut

-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero

Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de

Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-

formol Apregraves meacutelange

- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave

laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout

-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le

fond du tube

-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en

protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees

immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine

des noyaux est coloreacutee en brun par liode

Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent

donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol

sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement

leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes

- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou

directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension

de selles avec le colorant

Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des

protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux

apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs

jours

la coloration de Bailenger

Laisser pendant une nuit en contact

cristal violet 2 g

fuchsine basique 005 g

alcool agrave 95deg 20 ml

pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml

eau distilleacutee 100 ml

Coloration des frottis

Pour bien observer les structures nucleacuteaires et

garder des lames de reacutefeacuterence on

confectionne un frottis de selles humide et

eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en

- 3 temps fixation puis coloration puis

diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)

- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg

Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)

Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag

- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher

soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains

dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)

soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)

soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1

heure)

-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode

-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau

- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3

30 min agrave leacutetuve agrave 37deg

- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece

24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs

-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au

microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent

nettement

-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau

-Deacuteshydrater

-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est

poseacutee deacutefinitivement

- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les

trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure

des noyaux Les kystes apparaissent en bleu

pacircle avec des noyaux bien nets Cest une

technique facile agrave reacutealiser

- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible

- Plonger la lame dans le fixateur colorant de

Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures

- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au

baume de Canada ou au baume syntheacutetique

Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par

Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie

- Seacutechage

- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol

- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid

- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet

- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20

secondes en agitant

- Rinccedilage

-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5

- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100

- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert

Coloration des microscporidies

Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10

- Effectuer un frottis de la selle

- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de

meacutethanol

- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes

- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord

en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml

- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge

Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee

microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-

Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution

- Colorer pendant 3 heures

- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02

-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-

Rincer seacutecher et lire au grossissement x100

Coloration par Uvitex 2B

Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute

pour la chitine Met en eacutevidence les

microsporidie par une fluorescence

directe On obtient une

fluorescence bleue pale sur fond

noir

Scotch test anal ( test de Graham agrave

la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius

vermicularis ainsi que les anneaux ou les

oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors

de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est

appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant

toute toilette en position foetale ou genou

pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus

et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute

sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera

agrave lrsquoobjectif X10

NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les

parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que

la technique devra ecirctre faite avec des gants

ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite

pour eacuteviter la contamination par les oeufs

auto-infestant de lrsquooxyure

Meacutethodes speacuteciales

Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon

eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs

drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle

de la taille drsquoun petit pois

Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen

des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm

dans une quantiteacute de vert malachite agrave

3 (contre colorant) et de glyceacuterine

appliquer la bande sur la selle et sur la

lame renverser et appuyer sur la

paillasse

Methode de Kato-Katz quantitative

utilise un gabarie pour la selle

Meacutethode efficace pour la recherche

doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale

mais inutilisable pour les kytes et les

larves ainsi que les oeufs dankylostome

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

Suspension homo

+Tamisage +

2 agrave 3 heures

50 ml de solution

aceacuteto-aceacutetique formuleacutee

fraicircche

10 agrave 15 ml de la suspension

1800-2000 toursmin 90sec

rejeter le surnageant

L 1 en12humide

3 agrave 4 g de selles

Seacute

dim

en

tatio

n

8 agrave 10 ml de solution de saccharose

+ 05 ml de solution de chlorure

mercurique agrave 15 en ED

1000 toursmin 45 sec

deacutecanter le

surnageant

dans T2

L 2 en12humide

Flottation

T2 20 agrave 30 ml deau

2000 toursmin90 sec

L 3 en12humide

Preacutecipitation

Les colorations

utile en cas de doute lrsquoidentification des

kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces

des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires

coloreacutees

recommandeacutee pour la conservation de

mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre

laboratoire pour avis

indispensable pour le diagnostic de certains

parasites (Cryptosporides microsporides)

Meacutethodes de coloration rapides

(Colorations en tubes)

- Meacutethode de Bailenger et Faraggi

- Meacutethode de Sapro Lawless et

Strome

-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene

tamporeacute

-Meacutethode de Horkin

- Meacutethode de Sargeaut

-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero

Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de

Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-

formol Apregraves meacutelange

- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave

laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout

-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le

fond du tube

-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en

protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees

immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine

des noyaux est coloreacutee en brun par liode

Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent

donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol

sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement

leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes

- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou

directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension

de selles avec le colorant

Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des

protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux

apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs

jours

la coloration de Bailenger

Laisser pendant une nuit en contact

cristal violet 2 g

fuchsine basique 005 g

alcool agrave 95deg 20 ml

pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml

eau distilleacutee 100 ml

Coloration des frottis

Pour bien observer les structures nucleacuteaires et

garder des lames de reacutefeacuterence on

confectionne un frottis de selles humide et

eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en

- 3 temps fixation puis coloration puis

diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)

- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg

Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)

Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag

- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher

soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains

dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)

soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)

soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1

heure)

-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode

-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau

- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3

30 min agrave leacutetuve agrave 37deg

- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece

24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs

-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au

microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent

nettement

-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau

-Deacuteshydrater

-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est

poseacutee deacutefinitivement

- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les

trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure

des noyaux Les kystes apparaissent en bleu

pacircle avec des noyaux bien nets Cest une

technique facile agrave reacutealiser

- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible

- Plonger la lame dans le fixateur colorant de

Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures

- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au

baume de Canada ou au baume syntheacutetique

Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par

Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie

- Seacutechage

- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol

- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid

- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet

- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20

secondes en agitant

- Rinccedilage

-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5

- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100

- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert

Coloration des microscporidies

Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10

- Effectuer un frottis de la selle

- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de

meacutethanol

- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes

- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord

en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml

- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge

Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee

microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-

Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution

- Colorer pendant 3 heures

- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02

-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-

Rincer seacutecher et lire au grossissement x100

Coloration par Uvitex 2B

Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute

pour la chitine Met en eacutevidence les

microsporidie par une fluorescence

directe On obtient une

fluorescence bleue pale sur fond

noir

Scotch test anal ( test de Graham agrave

la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius

vermicularis ainsi que les anneaux ou les

oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors

de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est

appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant

toute toilette en position foetale ou genou

pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus

et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute

sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera

agrave lrsquoobjectif X10

NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les

parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que

la technique devra ecirctre faite avec des gants

ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite

pour eacuteviter la contamination par les oeufs

auto-infestant de lrsquooxyure

Meacutethodes speacuteciales

Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon

eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs

drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle

de la taille drsquoun petit pois

Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen

des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm

dans une quantiteacute de vert malachite agrave

3 (contre colorant) et de glyceacuterine

appliquer la bande sur la selle et sur la

lame renverser et appuyer sur la

paillasse

Methode de Kato-Katz quantitative

utilise un gabarie pour la selle

Meacutethode efficace pour la recherche

doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale

mais inutilisable pour les kytes et les

larves ainsi que les oeufs dankylostome

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

T2 20 agrave 30 ml deau

2000 toursmin90 sec

L 3 en12humide

Preacutecipitation

Les colorations

utile en cas de doute lrsquoidentification des

kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces

des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires

coloreacutees

recommandeacutee pour la conservation de

mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre

laboratoire pour avis

indispensable pour le diagnostic de certains

parasites (Cryptosporides microsporides)

Meacutethodes de coloration rapides

(Colorations en tubes)

- Meacutethode de Bailenger et Faraggi

- Meacutethode de Sapro Lawless et

Strome

-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene

tamporeacute

-Meacutethode de Horkin

- Meacutethode de Sargeaut

-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero

Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de

Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-

formol Apregraves meacutelange

- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave

laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout

-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le

fond du tube

-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en

protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees

immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine

des noyaux est coloreacutee en brun par liode

Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent

donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol

sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement

leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes

- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou

directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension

de selles avec le colorant

Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des

protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux

apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs

jours

la coloration de Bailenger

Laisser pendant une nuit en contact

cristal violet 2 g

fuchsine basique 005 g

alcool agrave 95deg 20 ml

pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml

eau distilleacutee 100 ml

Coloration des frottis

Pour bien observer les structures nucleacuteaires et

garder des lames de reacutefeacuterence on

confectionne un frottis de selles humide et

eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en

- 3 temps fixation puis coloration puis

diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)

- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg

Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)

Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag

- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher

soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains

dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)

soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)

soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1

heure)

-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode

-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau

- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3

30 min agrave leacutetuve agrave 37deg

- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece

24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs

-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au

microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent

nettement

-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau

-Deacuteshydrater

-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est

poseacutee deacutefinitivement

- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les

trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure

des noyaux Les kystes apparaissent en bleu

pacircle avec des noyaux bien nets Cest une

technique facile agrave reacutealiser

- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible

- Plonger la lame dans le fixateur colorant de

Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures

- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au

baume de Canada ou au baume syntheacutetique

Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par

Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie

- Seacutechage

- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol

- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid

- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet

- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20

secondes en agitant

- Rinccedilage

-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5

- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100

- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert

Coloration des microscporidies

Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10

- Effectuer un frottis de la selle

- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de

meacutethanol

- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes

- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord

en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml

- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge

Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee

microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-

Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution

- Colorer pendant 3 heures

- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02

-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-

Rincer seacutecher et lire au grossissement x100

Coloration par Uvitex 2B

Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute

pour la chitine Met en eacutevidence les

microsporidie par une fluorescence

directe On obtient une

fluorescence bleue pale sur fond

noir

Scotch test anal ( test de Graham agrave

la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius

vermicularis ainsi que les anneaux ou les

oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors

de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est

appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant

toute toilette en position foetale ou genou

pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus

et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute

sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera

agrave lrsquoobjectif X10

NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les

parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que

la technique devra ecirctre faite avec des gants

ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite

pour eacuteviter la contamination par les oeufs

auto-infestant de lrsquooxyure

Meacutethodes speacuteciales

Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon

eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs

drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle

de la taille drsquoun petit pois

Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen

des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm

dans une quantiteacute de vert malachite agrave

3 (contre colorant) et de glyceacuterine

appliquer la bande sur la selle et sur la

lame renverser et appuyer sur la

paillasse

Methode de Kato-Katz quantitative

utilise un gabarie pour la selle

Meacutethode efficace pour la recherche

doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale

mais inutilisable pour les kytes et les

larves ainsi que les oeufs dankylostome

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

Les colorations

utile en cas de doute lrsquoidentification des

kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces

des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires

coloreacutees

recommandeacutee pour la conservation de

mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre

laboratoire pour avis

indispensable pour le diagnostic de certains

parasites (Cryptosporides microsporides)

Meacutethodes de coloration rapides

(Colorations en tubes)

- Meacutethode de Bailenger et Faraggi

- Meacutethode de Sapro Lawless et

Strome

-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene

tamporeacute

-Meacutethode de Horkin

- Meacutethode de Sargeaut

-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero

Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de

Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-

formol Apregraves meacutelange

- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave

laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout

-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le

fond du tube

-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en

protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees

immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine

des noyaux est coloreacutee en brun par liode

Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent

donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol

sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement

leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes

- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou

directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension

de selles avec le colorant

Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des

protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux

apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs

jours

la coloration de Bailenger

Laisser pendant une nuit en contact

cristal violet 2 g

fuchsine basique 005 g

alcool agrave 95deg 20 ml

pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml

eau distilleacutee 100 ml

Coloration des frottis

Pour bien observer les structures nucleacuteaires et

garder des lames de reacutefeacuterence on

confectionne un frottis de selles humide et

eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en

- 3 temps fixation puis coloration puis

diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)

- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg

Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)

Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag

- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher

soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains

dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)

soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)

soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1

heure)

-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode

-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau

- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3

30 min agrave leacutetuve agrave 37deg

- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece

24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs

-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au

microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent

nettement

-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau

-Deacuteshydrater

-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est

poseacutee deacutefinitivement

- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les

trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure

des noyaux Les kystes apparaissent en bleu

pacircle avec des noyaux bien nets Cest une

technique facile agrave reacutealiser

- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible

- Plonger la lame dans le fixateur colorant de

Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures

- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au

baume de Canada ou au baume syntheacutetique

Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par

Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie

- Seacutechage

- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol

- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid

- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet

- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20

secondes en agitant

- Rinccedilage

-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5

- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100

- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert

Coloration des microscporidies

Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10

- Effectuer un frottis de la selle

- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de

meacutethanol

- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes

- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord

en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml

- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge

Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee

microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-

Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution

- Colorer pendant 3 heures

- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02

-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-

Rincer seacutecher et lire au grossissement x100

Coloration par Uvitex 2B

Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute

pour la chitine Met en eacutevidence les

microsporidie par une fluorescence

directe On obtient une

fluorescence bleue pale sur fond

noir

Scotch test anal ( test de Graham agrave

la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius

vermicularis ainsi que les anneaux ou les

oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors

de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est

appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant

toute toilette en position foetale ou genou

pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus

et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute

sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera

agrave lrsquoobjectif X10

NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les

parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que

la technique devra ecirctre faite avec des gants

ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite

pour eacuteviter la contamination par les oeufs

auto-infestant de lrsquooxyure

Meacutethodes speacuteciales

Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon

eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs

drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle

de la taille drsquoun petit pois

Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen

des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm

dans une quantiteacute de vert malachite agrave

3 (contre colorant) et de glyceacuterine

appliquer la bande sur la selle et sur la

lame renverser et appuyer sur la

paillasse

Methode de Kato-Katz quantitative

utilise un gabarie pour la selle

Meacutethode efficace pour la recherche

doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale

mais inutilisable pour les kytes et les

larves ainsi que les oeufs dankylostome

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

Meacutethodes de coloration rapides

(Colorations en tubes)

- Meacutethode de Bailenger et Faraggi

- Meacutethode de Sapro Lawless et

Strome

-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene

tamporeacute

-Meacutethode de Horkin

- Meacutethode de Sargeaut

-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero

Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de

Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-

formol Apregraves meacutelange

- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave

laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout

-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le

fond du tube

-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en

protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees

immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine

des noyaux est coloreacutee en brun par liode

Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent

donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol

sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement

leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes

- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou

directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension

de selles avec le colorant

Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des

protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux

apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs

jours

la coloration de Bailenger

Laisser pendant une nuit en contact

cristal violet 2 g

fuchsine basique 005 g

alcool agrave 95deg 20 ml

pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml

eau distilleacutee 100 ml

Coloration des frottis

Pour bien observer les structures nucleacuteaires et

garder des lames de reacutefeacuterence on

confectionne un frottis de selles humide et

eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en

- 3 temps fixation puis coloration puis

diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)

- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg

Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)

Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag

- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher

soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains

dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)

soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)

soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1

heure)

-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode

-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau

- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3

30 min agrave leacutetuve agrave 37deg

- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece

24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs

-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au

microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent

nettement

-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau

-Deacuteshydrater

-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est

poseacutee deacutefinitivement

- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les

trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure

des noyaux Les kystes apparaissent en bleu

pacircle avec des noyaux bien nets Cest une

technique facile agrave reacutealiser

- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible

- Plonger la lame dans le fixateur colorant de

Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures

- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au

baume de Canada ou au baume syntheacutetique

Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par

Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie

- Seacutechage

- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol

- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid

- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet

- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20

secondes en agitant

- Rinccedilage

-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5

- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100

- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert

Coloration des microscporidies

Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10

- Effectuer un frottis de la selle

- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de

meacutethanol

- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes

- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord

en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml

- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge

Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee

microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-

Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution

- Colorer pendant 3 heures

- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02

-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-

Rincer seacutecher et lire au grossissement x100

Coloration par Uvitex 2B

Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute

pour la chitine Met en eacutevidence les

microsporidie par une fluorescence

directe On obtient une

fluorescence bleue pale sur fond

noir

Scotch test anal ( test de Graham agrave

la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius

vermicularis ainsi que les anneaux ou les

oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors

de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est

appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant

toute toilette en position foetale ou genou

pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus

et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute

sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera

agrave lrsquoobjectif X10

NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les

parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que

la technique devra ecirctre faite avec des gants

ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite

pour eacuteviter la contamination par les oeufs

auto-infestant de lrsquooxyure

Meacutethodes speacuteciales

Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon

eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs

drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle

de la taille drsquoun petit pois

Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen

des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm

dans une quantiteacute de vert malachite agrave

3 (contre colorant) et de glyceacuterine

appliquer la bande sur la selle et sur la

lame renverser et appuyer sur la

paillasse

Methode de Kato-Katz quantitative

utilise un gabarie pour la selle

Meacutethode efficace pour la recherche

doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale

mais inutilisable pour les kytes et les

larves ainsi que les oeufs dankylostome

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero

Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de

Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-

formol Apregraves meacutelange

- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave

laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout

-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le

fond du tube

-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en

protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees

immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine

des noyaux est coloreacutee en brun par liode

Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent

donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol

sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement

leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes

- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou

directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension

de selles avec le colorant

Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des

protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux

apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs

jours

la coloration de Bailenger

Laisser pendant une nuit en contact

cristal violet 2 g

fuchsine basique 005 g

alcool agrave 95deg 20 ml

pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml

eau distilleacutee 100 ml

Coloration des frottis

Pour bien observer les structures nucleacuteaires et

garder des lames de reacutefeacuterence on

confectionne un frottis de selles humide et

eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en

- 3 temps fixation puis coloration puis

diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)

- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg

Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)

Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag

- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher

soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains

dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)

soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)

soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1

heure)

-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode

-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau

- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3

30 min agrave leacutetuve agrave 37deg

- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece

24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs

-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au

microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent

nettement

-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau

-Deacuteshydrater

-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est

poseacutee deacutefinitivement

- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les

trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure

des noyaux Les kystes apparaissent en bleu

pacircle avec des noyaux bien nets Cest une

technique facile agrave reacutealiser

- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible

- Plonger la lame dans le fixateur colorant de

Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures

- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au

baume de Canada ou au baume syntheacutetique

Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par

Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie

- Seacutechage

- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol

- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid

- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet

- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20

secondes en agitant

- Rinccedilage

-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5

- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100

- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert

Coloration des microscporidies

Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10

- Effectuer un frottis de la selle

- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de

meacutethanol

- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes

- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord

en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml

- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge

Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee

microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-

Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution

- Colorer pendant 3 heures

- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02

-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-

Rincer seacutecher et lire au grossissement x100

Coloration par Uvitex 2B

Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute

pour la chitine Met en eacutevidence les

microsporidie par une fluorescence

directe On obtient une

fluorescence bleue pale sur fond

noir

Scotch test anal ( test de Graham agrave

la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius

vermicularis ainsi que les anneaux ou les

oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors

de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est

appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant

toute toilette en position foetale ou genou

pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus

et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute

sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera

agrave lrsquoobjectif X10

NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les

parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que

la technique devra ecirctre faite avec des gants

ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite

pour eacuteviter la contamination par les oeufs

auto-infestant de lrsquooxyure

Meacutethodes speacuteciales

Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon

eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs

drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle

de la taille drsquoun petit pois

Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen

des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm

dans une quantiteacute de vert malachite agrave

3 (contre colorant) et de glyceacuterine

appliquer la bande sur la selle et sur la

lame renverser et appuyer sur la

paillasse

Methode de Kato-Katz quantitative

utilise un gabarie pour la selle

Meacutethode efficace pour la recherche

doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale

mais inutilisable pour les kytes et les

larves ainsi que les oeufs dankylostome

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou

directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension

de selles avec le colorant

Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des

protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux

apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs

jours

la coloration de Bailenger

Laisser pendant une nuit en contact

cristal violet 2 g

fuchsine basique 005 g

alcool agrave 95deg 20 ml

pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml

eau distilleacutee 100 ml

Coloration des frottis

Pour bien observer les structures nucleacuteaires et

garder des lames de reacutefeacuterence on

confectionne un frottis de selles humide et

eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en

- 3 temps fixation puis coloration puis

diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)

- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg

Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)

Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag

- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher

soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains

dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)

soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)

soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1

heure)

-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode

-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau

- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3

30 min agrave leacutetuve agrave 37deg

- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece

24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs

-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au

microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent

nettement

-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau

-Deacuteshydrater

-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est

poseacutee deacutefinitivement

- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les

trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure

des noyaux Les kystes apparaissent en bleu

pacircle avec des noyaux bien nets Cest une

technique facile agrave reacutealiser

- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible

- Plonger la lame dans le fixateur colorant de

Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures

- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au

baume de Canada ou au baume syntheacutetique

Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par

Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie

- Seacutechage

- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol

- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid

- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet

- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20

secondes en agitant

- Rinccedilage

-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5

- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100

- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert

Coloration des microscporidies

Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10

- Effectuer un frottis de la selle

- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de

meacutethanol

- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes

- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord

en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml

- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge

Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee

microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-

Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution

- Colorer pendant 3 heures

- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02

-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-

Rincer seacutecher et lire au grossissement x100

Coloration par Uvitex 2B

Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute

pour la chitine Met en eacutevidence les

microsporidie par une fluorescence

directe On obtient une

fluorescence bleue pale sur fond

noir

Scotch test anal ( test de Graham agrave

la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius

vermicularis ainsi que les anneaux ou les

oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors

de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est

appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant

toute toilette en position foetale ou genou

pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus

et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute

sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera

agrave lrsquoobjectif X10

NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les

parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que

la technique devra ecirctre faite avec des gants

ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite

pour eacuteviter la contamination par les oeufs

auto-infestant de lrsquooxyure

Meacutethodes speacuteciales

Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon

eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs

drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle

de la taille drsquoun petit pois

Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen

des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm

dans une quantiteacute de vert malachite agrave

3 (contre colorant) et de glyceacuterine

appliquer la bande sur la selle et sur la

lame renverser et appuyer sur la

paillasse

Methode de Kato-Katz quantitative

utilise un gabarie pour la selle

Meacutethode efficace pour la recherche

doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale

mais inutilisable pour les kytes et les

larves ainsi que les oeufs dankylostome

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

Coloration des frottis

Pour bien observer les structures nucleacuteaires et

garder des lames de reacutefeacuterence on

confectionne un frottis de selles humide et

eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en

- 3 temps fixation puis coloration puis

diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)

- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg

Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)

Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag

- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher

soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains

dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)

soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)

soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1

heure)

-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode

-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau

- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3

30 min agrave leacutetuve agrave 37deg

- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece

24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs

-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au

microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent

nettement

-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau

-Deacuteshydrater

-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est

poseacutee deacutefinitivement

- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les

trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure

des noyaux Les kystes apparaissent en bleu

pacircle avec des noyaux bien nets Cest une

technique facile agrave reacutealiser

- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible

- Plonger la lame dans le fixateur colorant de

Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures

- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au

baume de Canada ou au baume syntheacutetique

Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par

Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie

- Seacutechage

- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol

- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid

- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet

- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20

secondes en agitant

- Rinccedilage

-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5

- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100

- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert

Coloration des microscporidies

Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10

- Effectuer un frottis de la selle

- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de

meacutethanol

- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes

- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord

en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml

- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge

Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee

microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-

Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution

- Colorer pendant 3 heures

- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02

-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-

Rincer seacutecher et lire au grossissement x100

Coloration par Uvitex 2B

Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute

pour la chitine Met en eacutevidence les

microsporidie par une fluorescence

directe On obtient une

fluorescence bleue pale sur fond

noir

Scotch test anal ( test de Graham agrave

la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius

vermicularis ainsi que les anneaux ou les

oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors

de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est

appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant

toute toilette en position foetale ou genou

pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus

et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute

sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera

agrave lrsquoobjectif X10

NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les

parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que

la technique devra ecirctre faite avec des gants

ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite

pour eacuteviter la contamination par les oeufs

auto-infestant de lrsquooxyure

Meacutethodes speacuteciales

Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon

eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs

drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle

de la taille drsquoun petit pois

Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen

des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm

dans une quantiteacute de vert malachite agrave

3 (contre colorant) et de glyceacuterine

appliquer la bande sur la selle et sur la

lame renverser et appuyer sur la

paillasse

Methode de Kato-Katz quantitative

utilise un gabarie pour la selle

Meacutethode efficace pour la recherche

doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale

mais inutilisable pour les kytes et les

larves ainsi que les oeufs dankylostome

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag

- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher

soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains

dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)

soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)

soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1

heure)

-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode

-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau

- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3

30 min agrave leacutetuve agrave 37deg

- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece

24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs

-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au

microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent

nettement

-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau

-Deacuteshydrater

-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est

poseacutee deacutefinitivement

- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les

trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure

des noyaux Les kystes apparaissent en bleu

pacircle avec des noyaux bien nets Cest une

technique facile agrave reacutealiser

- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible

- Plonger la lame dans le fixateur colorant de

Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures

- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au

baume de Canada ou au baume syntheacutetique

Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par

Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie

- Seacutechage

- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol

- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid

- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet

- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20

secondes en agitant

- Rinccedilage

-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5

- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100

- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert

Coloration des microscporidies

Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10

- Effectuer un frottis de la selle

- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de

meacutethanol

- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes

- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord

en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml

- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge

Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee

microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-

Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution

- Colorer pendant 3 heures

- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02

-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-

Rincer seacutecher et lire au grossissement x100

Coloration par Uvitex 2B

Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute

pour la chitine Met en eacutevidence les

microsporidie par une fluorescence

directe On obtient une

fluorescence bleue pale sur fond

noir

Scotch test anal ( test de Graham agrave

la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius

vermicularis ainsi que les anneaux ou les

oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors

de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est

appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant

toute toilette en position foetale ou genou

pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus

et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute

sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera

agrave lrsquoobjectif X10

NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les

parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que

la technique devra ecirctre faite avec des gants

ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite

pour eacuteviter la contamination par les oeufs

auto-infestant de lrsquooxyure

Meacutethodes speacuteciales

Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon

eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs

drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle

de la taille drsquoun petit pois

Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen

des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm

dans une quantiteacute de vert malachite agrave

3 (contre colorant) et de glyceacuterine

appliquer la bande sur la selle et sur la

lame renverser et appuyer sur la

paillasse

Methode de Kato-Katz quantitative

utilise un gabarie pour la selle

Meacutethode efficace pour la recherche

doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale

mais inutilisable pour les kytes et les

larves ainsi que les oeufs dankylostome

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les

trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure

des noyaux Les kystes apparaissent en bleu

pacircle avec des noyaux bien nets Cest une

technique facile agrave reacutealiser

- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible

- Plonger la lame dans le fixateur colorant de

Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures

- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au

baume de Canada ou au baume syntheacutetique

Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par

Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie

- Seacutechage

- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol

- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid

- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet

- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20

secondes en agitant

- Rinccedilage

-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5

- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100

- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert

Coloration des microscporidies

Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10

- Effectuer un frottis de la selle

- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de

meacutethanol

- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes

- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord

en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml

- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge

Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee

microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-

Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution

- Colorer pendant 3 heures

- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02

-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-

Rincer seacutecher et lire au grossissement x100

Coloration par Uvitex 2B

Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute

pour la chitine Met en eacutevidence les

microsporidie par une fluorescence

directe On obtient une

fluorescence bleue pale sur fond

noir

Scotch test anal ( test de Graham agrave

la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius

vermicularis ainsi que les anneaux ou les

oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors

de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est

appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant

toute toilette en position foetale ou genou

pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus

et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute

sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera

agrave lrsquoobjectif X10

NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les

parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que

la technique devra ecirctre faite avec des gants

ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite

pour eacuteviter la contamination par les oeufs

auto-infestant de lrsquooxyure

Meacutethodes speacuteciales

Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon

eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs

drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle

de la taille drsquoun petit pois

Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen

des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm

dans une quantiteacute de vert malachite agrave

3 (contre colorant) et de glyceacuterine

appliquer la bande sur la selle et sur la

lame renverser et appuyer sur la

paillasse

Methode de Kato-Katz quantitative

utilise un gabarie pour la selle

Meacutethode efficace pour la recherche

doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale

mais inutilisable pour les kytes et les

larves ainsi que les oeufs dankylostome

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par

Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie

- Seacutechage

- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol

- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid

- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet

- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20

secondes en agitant

- Rinccedilage

-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5

- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100

- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert

Coloration des microscporidies

Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10

- Effectuer un frottis de la selle

- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de

meacutethanol

- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes

- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord

en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml

- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge

Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee

microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-

Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution

- Colorer pendant 3 heures

- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02

-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-

Rincer seacutecher et lire au grossissement x100

Coloration par Uvitex 2B

Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute

pour la chitine Met en eacutevidence les

microsporidie par une fluorescence

directe On obtient une

fluorescence bleue pale sur fond

noir

Scotch test anal ( test de Graham agrave

la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius

vermicularis ainsi que les anneaux ou les

oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors

de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est

appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant

toute toilette en position foetale ou genou

pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus

et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute

sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera

agrave lrsquoobjectif X10

NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les

parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que

la technique devra ecirctre faite avec des gants

ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite

pour eacuteviter la contamination par les oeufs

auto-infestant de lrsquooxyure

Meacutethodes speacuteciales

Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon

eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs

drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle

de la taille drsquoun petit pois

Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen

des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm

dans une quantiteacute de vert malachite agrave

3 (contre colorant) et de glyceacuterine

appliquer la bande sur la selle et sur la

lame renverser et appuyer sur la

paillasse

Methode de Kato-Katz quantitative

utilise un gabarie pour la selle

Meacutethode efficace pour la recherche

doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale

mais inutilisable pour les kytes et les

larves ainsi que les oeufs dankylostome

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10

- Effectuer un frottis de la selle

- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de

meacutethanol

- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes

- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord

en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml

- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge

Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee

microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-

Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution

- Colorer pendant 3 heures

- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02

-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-

Rincer seacutecher et lire au grossissement x100

Coloration par Uvitex 2B

Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute

pour la chitine Met en eacutevidence les

microsporidie par une fluorescence

directe On obtient une

fluorescence bleue pale sur fond

noir

Scotch test anal ( test de Graham agrave

la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius

vermicularis ainsi que les anneaux ou les

oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors

de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est

appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant

toute toilette en position foetale ou genou

pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus

et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute

sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera

agrave lrsquoobjectif X10

NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les

parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que

la technique devra ecirctre faite avec des gants

ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite

pour eacuteviter la contamination par les oeufs

auto-infestant de lrsquooxyure

Meacutethodes speacuteciales

Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon

eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs

drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle

de la taille drsquoun petit pois

Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen

des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm

dans une quantiteacute de vert malachite agrave

3 (contre colorant) et de glyceacuterine

appliquer la bande sur la selle et sur la

lame renverser et appuyer sur la

paillasse

Methode de Kato-Katz quantitative

utilise un gabarie pour la selle

Meacutethode efficace pour la recherche

doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale

mais inutilisable pour les kytes et les

larves ainsi que les oeufs dankylostome

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee

microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-

Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution

- Colorer pendant 3 heures

- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02

-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-

Rincer seacutecher et lire au grossissement x100

Coloration par Uvitex 2B

Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute

pour la chitine Met en eacutevidence les

microsporidie par une fluorescence

directe On obtient une

fluorescence bleue pale sur fond

noir

Scotch test anal ( test de Graham agrave

la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius

vermicularis ainsi que les anneaux ou les

oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors

de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est

appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant

toute toilette en position foetale ou genou

pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus

et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute

sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera

agrave lrsquoobjectif X10

NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les

parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que

la technique devra ecirctre faite avec des gants

ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite

pour eacuteviter la contamination par les oeufs

auto-infestant de lrsquooxyure

Meacutethodes speacuteciales

Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon

eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs

drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle

de la taille drsquoun petit pois

Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen

des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm

dans une quantiteacute de vert malachite agrave

3 (contre colorant) et de glyceacuterine

appliquer la bande sur la selle et sur la

lame renverser et appuyer sur la

paillasse

Methode de Kato-Katz quantitative

utilise un gabarie pour la selle

Meacutethode efficace pour la recherche

doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale

mais inutilisable pour les kytes et les

larves ainsi que les oeufs dankylostome

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

Scotch test anal ( test de Graham agrave

la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius

vermicularis ainsi que les anneaux ou les

oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors

de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est

appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant

toute toilette en position foetale ou genou

pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus

et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute

sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera

agrave lrsquoobjectif X10

NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les

parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que

la technique devra ecirctre faite avec des gants

ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite

pour eacuteviter la contamination par les oeufs

auto-infestant de lrsquooxyure

Meacutethodes speacuteciales

Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon

eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs

drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle

de la taille drsquoun petit pois

Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen

des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm

dans une quantiteacute de vert malachite agrave

3 (contre colorant) et de glyceacuterine

appliquer la bande sur la selle et sur la

lame renverser et appuyer sur la

paillasse

Methode de Kato-Katz quantitative

utilise un gabarie pour la selle

Meacutethode efficace pour la recherche

doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale

mais inutilisable pour les kytes et les

larves ainsi que les oeufs dankylostome

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon

eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs

drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle

de la taille drsquoun petit pois

Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen

des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm

dans une quantiteacute de vert malachite agrave

3 (contre colorant) et de glyceacuterine

appliquer la bande sur la selle et sur la

lame renverser et appuyer sur la

paillasse

Methode de Kato-Katz quantitative

utilise un gabarie pour la selle

Meacutethode efficace pour la recherche

doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale

mais inutilisable pour les kytes et les

larves ainsi que les oeufs dankylostome

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule

(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et

le thermotropisme des larves

Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis

meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un

entonnoire

Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant

suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc

fermeacute par une pince

on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la

tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le

niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute

NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des

neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave

lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable

Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour

recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On

centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine

le culot

NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent

parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions

manuelles lors de la manipulation

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

La coproculture

La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave

deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens

reacutepeacuteteacutes

- Coproculture en protozoologie( sans

les sporozoaires)

- En protozoologie (coccidies )

- En helminthologie

Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les

fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir

des formes plus facilement identifiables Elle

srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des

strongles digestifs

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

En protozoologie (sans les

sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour

protozoaires permet la multiplication de rares amibes

ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le

diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine

Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique

avec 2 parties

-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute

-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties

de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus

amidon de riz

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie

dans les selles pour affirmer le diagnostic de

genre et despegravece il est neacutecessaire de

provoquer leur maturation par une coproculture

agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles

leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau

distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu

de poudre de charbon ou de solution dacide

chromique agrave 05 pour eacuteviter les

fermentations La lecture sera effectueacutee tous

les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les

sporozoiumltes seront formeacutes

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules

(cycle sexueacute) ne soit pas toujours

observeacutee une coproculture positive peut

permettre daffirmer un diagnostic quune

concentration ou une extraction de

Baermann nauraient pu prouver

Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri

Culture sur buvard en tube agrave essai

Culture sur charbon

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

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spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif

Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par

la reacutepeacutetition des preacutelegravevements

-Confusions et faux positif

reacutesidus alimentaires graisses savons

amidon

pollens

spores de champignons

eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules

eacutepitheacuteliales)

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

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Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

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Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)

Cristaux de Charcot Leyden

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Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

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Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux

Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal

Vaisseau spiraleacute

Bois veacutegeacutetal

Placard eacutepidermique

(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

Reacutesidus digestifs animaux

Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol

Cristaux

Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien

Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol