15507124 Tp Dosage de Luree Plasmatique

TP N03TP N03TP N03TP N03

Dosage lure plasmatique

Rpublique algrienne dmocratique et populaire. Universit Djillali Liabes

Facult de Mdecine Dpartement de Pharmacie

Anne universitaire : 2008 / 2009

Ralise par:

GHERMI Mohamed. BETTAYEB Mohamed Amine. TAHRI Mahmoud. CHAREF KHODJA Meriem.

4 me anne pharmacie G05.

TP N 3 DOSAGE DE LUREE PLASMATIQUE (AZOTEMIE)

1 RAFUNIT - UDL - Pharmacie

L'ure, molcule trs hydrosoluble, est la forme principale d'limination des

dchets azots du mtabolisme des protines chez l'Homme. La dtermination de

l'ure dans le sang longtemps pratique pour valuer la fonction rnale a t

supplante par celle de la cratinine.

L'ure est le compos azot le plus abondant de l'urine humaine. Son dosage dans

l'urine est un tmoin du mtabolisme protidique permettant de comparer les

pertes quotidiennes l'azote aux apports.

Le dosage de l'ure dans le sang est gnralement pratiqu en faisant appel une

mthode enzymatique (urase).

IIII---- Intrt physiopathologiqueIntrt physiopathologiqueIntrt physiopathologiqueIntrt physiopathologique ::::

L'ure est une molcule trs hydrosoluble, lectriquement neutre. C'est la forme principale d'limination des dchets azots du mtabolisme des protines chez l'Homme. La plus grande partie de l'ammoniac (NH3), produit dans le foie par la dsamination des acides amins, est transforme en ure (urogense ou cycle de Krebs-Henseleit), au niveau du foie et du cerveau. L'ure est compltement filtre par le glomrule et rabsorbe partiellement au niveau du nphron, de faon inversement proportionnelle au dbit urinaire. L'ure est la premire substance dont l'augmentation dans le plasma a t associe au mal de Bright. ce titre, elle fut longtemps utilise pour apprcier la fonction rnale. La concentration de l'ure sanguine (ou urmie), correspond un quilibre entre sa production, le volume de diffusion (correspond l'eau totale, soit environ 60% du poids corporel), et son excrtion urinaire. tant donn tous les facteurs extrarnaux susceptibles d'influencer l'urmie, pour valuer la fonction rnale, le dosage de la cratinine dans le sang et dans l'urine lui a t prfr. De mme, le calcul de la clairance de l'ure a t remplac par celui de la clairance de la cratinine. L'ure est le compos azot le plus abondant de l'urine humaine. Son dosage contribue l'exploration de la fonction rnale, et chez le sujet sans affection hpatique ou rnale, il est un tmoin du mtabolisme protidique permettant de comparer les pertes quotidiennes d'azote aux apports prescrits et ainsi de suspecter une mauvaise observance un rgime ou un tat hypercatabolique si l'excrtion d'azote est suprieure aux entres.

TP N 3

2

IIIIIIII---- Mtabolisme de lure (Cycle de lure)Mtabolisme de lure (Cycle de lure)Mtabolisme de lure (Cycle de lure)Mtabolisme de lure (Cycle de lure)

L'ammoniaque, produit final du catabolisme protique et toxique pour le

systme nerveux central, est limin de l'organisme par sa transformation en ure

au niveau hpatique. Cette

cycle de l'ure, constitue de six tapes

mitochondriale et le cytosol de la cellule hpatique

suivants : N-actylglutamate synthase [NAGS], carba

[CPSI], ornithine transcarbamylase [OTC], argininosuccinate synthtase [ASS],

argininosuccinate lyase [ASL], arginase [ARG]

Certaines de ces enzymes peuvent se retrouver dans d'autres tissus; elles ont

alors un autre rle. Tout d

l'apparition d'une hyperammonimie. Celui

dltre touchant un gne codant pour une des enzymes impliques ou d'une

inhibition d'une des enzymes cause par l'accu

endogne (aciduries organiques) ou exogne (valproate). Dans le cas d'un

dysfonctionnement d'origine gntique, il est important de caractriser

prcisment l'tape dfectueuse dans un but thrapeutique et de conseil gntiq

DOSAGE DE LUREE PLASMATIQUE (AZOTEMIE)

RAFUNIT - UDL

Mtabolisme de lure (Cycle de lure)Mtabolisme de lure (Cycle de lure)Mtabolisme de lure (Cycle de lure)Mtabolisme de lure (Cycle de lure) ::::


central, est limin de l'organisme par sa transformation en ure

au niveau hpatique. Cette limination est ralise par une voie mtabolique, le

cycle de l'ure, constitue de six tapes enzymatiques rparties entre la matrice

mitochondriale et le cytosol de la cellule hpatique, ces 6 enzymes sont les

actylglutamate synthase [NAGS], carbamylphosphate synthtase I


ate lyase [ASL], arginase [ARG].


Tout dysfonctionnement de cette voie mtabolique entranera

l'apparition d'une hyperammonimie. Celui-ci peut tre le rsultat d'une mutation


inhibition d'une des enzymes cause par l'accumulation d'un compos d'origine



prcisment l'tape dfectueuse dans un but thrapeutique et de conseil gntiq

SMATIQUE (AZOTEMIE)

UDL - Pharmacie


central, est limin de l'organisme par sa transformation en ure

ion est ralise par une voie mtabolique, le

enzymatiques rparties entre la matrice

, ces 6 enzymes sont les

mylphosphate synthtase I



ysfonctionnement de cette voie mtabolique entranera

ci peut tre le rsultat d'une mutation


mulation d'un compos d'origine



prcisment l'tape dfectueuse dans un but thrapeutique et de conseil gntique.



IIIIIIIIIIII---- Dosages de lure dans lorganismeDosages de lure dans lorganismeDosages de lure dans lorganismeDosages de lure dans lorganisme :::: 1111---- Etape prEtape prEtape prEtape pr----analytiqueanalytiqueanalytiqueanalytique ::::

aaaa---- Ure sanguineUre sanguineUre sanguineUre sanguine :::: L'ure tant trs diffusible, sa concentration est identique dans le plasma et les globules rouges. Les rsultats obtenus partir du plasma, du srum, ou du sang sont quivalents. Le prlvement est de prfrence effectu chez le sujet jeun. Le sang est recueilli dans des tubes avec ou sans anticoagulant. Le fluorure de sodium est viter car il inhibe l'urase utilise dans les techniques enzymatiques contrairement l'iodoactate qui ne l'affecte pas.

bbbb---- Ure urinaireUre urinaireUre urinaireUre urinaire : : : : Le dosage est effectu, soit sur un chantillon des urines de 24 heures, soit sur une miction. tant donn la consommation possible de l'ure par des germes possdant une urase, les urines peuvent tre conserves pendant 7 jours +4C ou 1 mois -20C.

2222---- Techniques de dosagesTechniques de dosagesTechniques de dosagesTechniques de dosages :::: aaaa---- Techniques chimiquesTechniques chimiquesTechniques chimiquesTechniques chimiques ::::

Mthode lhypobromiteMthode lhypobromiteMthode lhypobromiteMthode lhypobromite de Nade Nade Nade Na:::: L'ure est traite par une solution alcaline d'hypobromite de sodium, ce qui donne un dgagement d'azote qui est mesur dans l'uromtre et compar l'azote dgag, dans les mmes conditions, par une solution d'ure de titre connu. La dfcation du srum est effectue par une solution d'acide trichloractique. L'appareillage tait reprsent par l'uromtre d'Yvon et une cuve mercure. Cette technique, applicable aussi bien au srum qu' l'urine n'est plus utilise depuis longtemps, mais c'est elle qui a donn le nom d'azotmie au taux d'ure dans le sang.

Mthode la diactyl monoximeMthode la diactyl monoximeMthode la diactyl monoximeMthode la diactyl monoxime (DAM):(DAM):(DAM):(DAM): L'ure ragit chaud avec la DAM, en prsence d'ions ferriques, pour former une coloration rose qui peut tre sensibilise et stabilise par des adjuvants tels que le thiosemicarbazide, cette coloration peut tre dose par mesure de labsorbance 520 nm (dosage colorimtrique). Cette mthode est souvent utilise aprs dprotinisation, mais elle peut aussi tre utilise directement. La parfaite proportionnalit entre l'absorbance et le taux de l'ure autorise l'emploi de 2 ou 3 talons seulement.

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Le seuil de dtection est de 10 P

Une courbe dtalonnage de labsorbance en fonction de la

concentration dure est trace

La courbe dtalonnage de lure est une droite pour une gamme

de concentrations comprise entre 0 et 30 ppb.

La raction chimique est la suivante


RAFUNIT - UDL

Le seuil de dtection est de 10 PP


concentration dure est trace :


de concentrations comprise entre 0 et 30 ppb.

La raction chimique est la suivante :

SMATIQUE (AZOTEMIE)

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TP N 3

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Le facteur

doit tre rigoureusement identique et constante pour toutes les

solutions talons

Cette mthode est dsormais abandonne.Cette mthode est dsormais abandonne.Cette mthode est dsormais abandonne.Cette mthode est dsormais abandonne.

bbbb---- Techniques enzymatiquesTechniques enzymatiquesTechniques enzymatiquesTechniques enzymatiques

L'ure est principalement dose par des mthodes ba

prliminaire de l'urase

Les techniques enzymatiques utilises par moins de 20% des

laboratoires il y a 30 ans sont

Urase/glutamate dshydrognase, Urase/glutamate dshydrognase, Urase/glutamate dshydrognase, Urase/glutamate dshydrognase,

Elles exploitent le schma ractionnel

Dans les conditions opratoires choisies, la vitesse de disparition du

NADH est proportionnelle la concentration d'ure dans

l'chantillon. La lecture est effectue 340 nm.

Cette technique peut tre effectue en cintique ou en point final.

Technique lectrochimiqueTechnique lectrochimiqueTechnique lectrochimiqueTechnique lectrochimique

L'urase dgrade l'ure en NH

mesure la cintique de la variation de la conductivit avec une

lectrode slective de

Technique rflectomtriqueTechnique rflectomtriqueTechnique rflectomtriqueTechnique rflectomtrique

Les plaques sont constitues de plusieurs couches ractionnelles sur

un support

l'hydrolyse de l'ure en

l'ammoniac et du gaz carbonique. Une

permet de dterminer par rflectomtrie la concentration en

ammoniac produit.

Cette mthode analytique l'avantage d'tre spcifique, rapide et

d'viter l'utilisation de produits corrosifs ainsi que la

dprotinisation.


RAFUNIT - UDL

Le facteur cl de ce dosage est la temprature de chauffage qui


solutions talons.

Cette mthode est dsormais abandonne.Cette mthode est dsormais abandonne.Cette mthode est dsormais abandonne.Cette mthode est dsormais abandonne.

Techniques enzymatiquesTechniques enzymatiquesTechniques enzymatiquesTechniques enzymatiques ::::

L'ure est principalement dose par des mthodes bases sur l'action

prliminaire de l'urase suivie de ractions auxiliaires diffrentes.


aboratoires il y a 30 ans sont aujourd'hui trs largement majoritaires.

Urase/glutamate dshydrognase, Urase/glutamate dshydrognase, Urase/glutamate dshydrognase, Urase/glutamate dshydrognase, mesure 340 nmmesure 340 nmmesure 340 nmmesure 340 nm ::::

Elles exploitent le schma ractionnel suivant :



l'chantillon. La lecture est effectue 340 nm.

hnique peut tre effectue en cintique ou en point final.

Technique lectrochimiqueTechnique lectrochimiqueTechnique lectrochimiqueTechnique lectrochimique ::::

L'urase dgrade l'ure en NH4+ qui fait varier la conductivit. On

cintique de la variation de la conductivit avec une

lectrode slective de conductivit.

Technique rflectomtriqueTechnique rflectomtriqueTechnique rflectomtriqueTechnique rflectomtrique ::::


en polyester. La mthode analytique est base sur

l'hydrolyse de l'ure en prsence d'urase pour donner de

l'ammoniac et du gaz carbonique. Une raction colorimtrique


ammoniac produit.


l'utilisation de produits corrosifs ainsi que la

dprotinisation.

SMATIQUE (AZOTEMIE)

UDL - Pharmacie

cl de ce dosage est la temprature de chauffage qui


ses sur l'action

suivie de ractions auxiliaires diffrentes.


aujourd'hui trs largement majoritaires.



hnique peut tre effectue en cintique ou en point final.

qui fait varier la conductivit. On

cintique de la variation de la conductivit avec une


en polyester. La mthode analytique est base sur

prsence d'urase pour donner de

colorimtrique





Mthode colMthode colMthode colMthode colorimtrique de Berthelotorimtrique de Berthelotorimtrique de Berthelotorimtrique de Berthelot ::::

Les ions ammonium produits par l'action de l'urase ragissent en

milieu alcalin avec l'hypochlorite de Na, en prsence de

nitroprussiate de Na, pour former une monochloramine qui dans un

2me temps ragit avec deux phnols pour former un indophnol

responsable du dveloppement de la coloration verte mesure

580nm.

Technique de rfrenceTechnique de rfrenceTechnique de rfrenceTechnique de rfrence ::::

Une technique utilisant le couple urase/glutamate-dshydrognase

a t propose par le Center for Disease Control (CDC) comme

technique de rfrence pour le dosage de l'ure sanguine.

IVIVIVIV---- Application au TP (Echantillon N105)Application au TP (Echantillon N105)Application au TP (Echantillon N105)Application au TP (Echantillon N105) :::: 1111---- RactifRactifRactifRactif ::::

R1 : Nitroprussiate de Na (catalyeur) + Urase.

R2 : Hypochlorite de Na + NaOH.

[Etalon] = 0,5 g/l0,5 g/l0,5 g/l0,5 g/l.

2222---- EchantillonEchantillonEchantillonEchantillon :::: Srum (N105N105N105N105).

Faire une dilution au 1/31/31/31/3.

3333---- Mthode et mode opratoireMthode et mode opratoireMthode et mode opratoireMthode et mode opratoire :::: La mthode utilise est celle de la mthode colorimtrique de Berthelot.

Les diffrentes tapes sont rsumes dans le tableau suivant :

BlancBlancBlancBlanc EtalonEtalonEtalonEtalon EchantillonEchantillonEchantillonEchantillon

Eau distilleEau distilleEau distilleEau distille 20 l / /

EtalonEtalonEtalonEtalon / 20 l /

EchantillonEchantillonEchantillonEchantillon / / 20 l

R1R1R1R1 2 ml 2 ml 2 ml

Laisser T ambiante pendant 10mn.Laisser T ambiante pendant 10mn.Laisser T ambiante pendant 10mn.Laisser T ambiante pendant 10mn.

R2R2R2R2 2 ml 2 ml 2 ml

Bien mlanger pendant quelques minutes puis lecture au

spectrophotomtre =580 nm=580 nm=580 nm=580 nm.



4444---- RsultatsRsultatsRsultatsRsultats :::: Les rsultats obtenus sont les suivants :

ETALONETALONETALONETALON ECHANTILLONECHANTILLONECHANTILLONECHANTILLON

DODODODO 0,450 0,670

[Ure] =

(dilution)-1

[Ure] = ,

, 0,5 3

[Ure] 1 g/l 16,67 mmol/l16,67 mmol/l16,67 mmol/l16,67 mmol/l.

5555---- Interprtation des rsultatsInterprtation des rsultatsInterprtation des rsultatsInterprtation des rsultats :::: Avant tous, on citera les valeurs normales de lurmie et celle de lururie.

Urmie N Urmie N Urmie N Urmie N

(mmol/l)(mmol/l)(mmol/l)(mmol/l)

Urmie N Urmie N Urmie N Urmie N

(g/l)(g/l)(g/l)(g/l)

NouveauNouveauNouveauNouveau----n (< 4 jours)n (< 4 jours)n (< 4 jours)n (< 4 jours) 1,5 - 8,0 0,09 - 0,48

NouveauNouveauNouveauNouveau----n (> 4 jours)n (> 4 jours)n (> 4 jours)n (> 4 jours) 1,0 - 4,2 0,06 - 0,25

Nourrisson et enfant jusqu' Nourrisson et enfant jusqu' Nourrisson et enfant jusqu' Nourrisson et enfant jusqu'

5555----6 ans6 ans6 ans6 ans

1,6 - 6,5 0,10 - 0,40

Enfant de Enfant de Enfant de Enfant de plus de 7 ans et plus de 7 ans et plus de 7 ans et plus de 7 ans et

adulteadulteadulteadulte

2,5 - 7,5 0,15 - 0,45

En ce qui concerne le taux urinaire, les valeurs normales sont comprises

entre 300 et 500 mmol/24 h (soit 18 30 g/24 h).300 et 500 mmol/24 h (soit 18 30 g/24 h).300 et 500 mmol/24 h (soit 18 30 g/24 h).300 et 500 mmol/24 h (soit 18 30 g/24 h).

RemarqueRemarqueRemarqueRemarque ::::

Dans les pays anglo-saxons, le dosage de l'ure dans les liquides

biologiques est exprim non par molcule d'ure mais par

concentration d'azote urique exprime en g/L, qu'il faut multiplier par

deux pour obtenir l'ure plasmatique en g/L.



InterprtationInterprtationInterprtationInterprtation :

Les valeurs obtenues (16,67 mmol/l 1g/l) sont suprieurs (2x) les valeurs

usuelles ce qui pourrait rsulter de deux mcanismes essentielles que sont :

Par dfaut d'excrtion rnalePar dfaut d'excrtion rnalePar dfaut d'excrtion rnalePar dfaut d'excrtion rnale ::::

L'hyperurmie est alors nette, souvent suprieure 16 mmol/L.

Elle est accompagne d'une baisse de l'limination urinaire de l'ure.

Ce dfaut d'excrtion (insuffisance rnale) peut avoir plusieurs

origines :

- Origine prrnale : il peut s'agir d'une oligurie que l'on rencontre

dans les insuffisances cardiaques ou les cirrhoses ascitiques, ou d'une

dshydratation extracellulaire due une fuite hydrosode conscutive

une diarrhe et/ou des vomissements.

- Origine rnale : les nphropathies aigus (glomrulonphrites,

pylonphrites), ou chroniques entranent l'installation d'une

insuffisance rnale de faon brutale ou progressive.

- Origine post-rnale : l'insuffisance rnale est lie la prsence d'une

obstruction au niveau de l'appareil urinaire (c'est le cas, par exemple,

d'un cancer ou d'un adnome prostatique).

Par formation excessive d'urePar formation excessive d'urePar formation excessive d'urePar formation excessive d'ure ::::

Un rgime trop riche en protines, ou un hypercatabolisme protidique

(fivres et infections aigus, dnutrition associe une myolyse

importante, ou traitement par des corticodes) sont l'origine d'une

augmentation de l'ure sanguine, qui s'accompagne, la fonction rnale

tant normale, d'une augmentation parallle de son excrtion urinaire.

Autres variationsAutres variationsAutres variationsAutres variations ::::

Variations physiologiquesVariations physiologiquesVariations physiologiquesVariations physiologiques ::::

Les variations de l'ure dans les liquides biologiques sont trs

dpendantes des apports alimentaires.

Les nouveau-ns de plus de 4 jours et les nourrissons prsentent

des concentrations d'ure plasmatiques infrieures d'environ

40% par rapport aux concentrations observes chez les adultes.

Les valeurs leves observes la naissance correspondent

l'pisode d'insuffisance rnale nonatale.

La concentration d'ure dans le sang augmente avec l'ge. Ainsi,

aprs 50 ans une urmie 8 mmol/L n'est pas considre comme

pathologique.

Chez la femme, l'urmie est infrieure de 25% celle de

l'homme.Elle est abaisse au cours de la grossesse, du fait de

l'augmentation de l'espace liquidien.



Diminution de lurmieDiminution de lurmieDiminution de lurmieDiminution de lurmie ::::

Elle ne s'observe que rarement :

Dans les carences importantes en protines alimentaires (ou les

malabsorptions digestives).

Dans les insuffisances hpatiques graves avec un effondrement

de l'urogense.

En cas de dficit enzymatique au niveau du cycle de

l'urogense.

Dans tous les cas, l'excrtion urinaire de l'ure est abaisse.

VVVV---- Applications pratiquesApplications pratiquesApplications pratiquesApplications pratiques :::: 1111---- Intrt de la mesure conjointe de l'ure Intrt de la mesure conjointe de l'ure Intrt de la mesure conjointe de l'ure Intrt de la mesure conjointe de l'ure et la cratinine et la cratinine et la cratinine et la cratinine

sanguinesanguinesanguinesanguine ::::

Le dosage de l'ure en pratique clinique n'a d'intrt qu'associ celui

de la cratinine dans le cas d'une insuffisance rnale dont on souhaite

savoir si elle est fonctionnelle ou organique. En effet, le rapport

ure/cratinine plasmatique molaire normal est d'environ 50. Lorsque ce

rapport U/C plasmatique devient suprieur 100, l'lvation

disproportionne de l'ure sanguine par rapport celle de la cratinine doit

faire rechercher soit une hyperproduction d'ure, soit une insuffisance

rnale fonctionnelle (l'ure, petite molcule facilement diffusible est

rabsorbe passivement dans la mdullaire rnale dans toutes les situations

dbit urinaire faible).

2222---- Intrt du dosage de l'ure urinaireIntrt du dosage de l'ure urinaireIntrt du dosage de l'ure urinaireIntrt du dosage de l'ure urinaire

La mesure de la concentration peut servir au diagnostic diffrentiel

entre une insuffisance rnale organique et une insuffisance rnale

fonctionnelle. De plus, elle permet de calculer l'osmolarit des urines et son

rapport avec l'osmolarit du plasma.

La mesure de l'excrtion urique urinaire des 24 heures permet d'valuer

l'observance d'un rgime protidique prescrit. Ce recueil devra tre valid

par la comparaison avec la cratininurie des 24 heures.

Un apport protidique normal se situe entre 1 et 2 g/kg/24 h, ce qui

correspond, pour un sujet de 60 kg, 335 670 mmol d'ure excrte par 24

heures.

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