1 mL de préculture de MH20-22B
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1 mL de préculture de MH20-22B
49mL de milieu CGXIII + 30 mmol.L-1
Mise en culture a 30°C à 104 rotation.min-1 pendant 72H
Prélever stérilement 2mL de cette culture au temps 0,3,6,24,48, et 72H
Mesure de la DO à 600 nm au temps 0 ,0,5 ,1 ,1,5 ,2 ,2,5 ,3 3,5 ,4 ,4,5 ,5 ,5,5 ,6 ,24 ,48 , et 72H
Centrifuger à 5000 x g pendant 10 minutes
Récupérer le surnagentDosage des sucres réducteurs
Dosage des acides aminés
Préparation de la solution étalon de glucose à 10 mM Préparation de la solution étalon de
Lysine à 0,002MEffectuer un pré-test ,pour éventuellement ajuster le volume de prise d’essai (en suivant la procédure ci-dessous
Effectuer un pré-test ,pour éventuellement ajuster le volume de prise d’essai
Effectuer une gamme étalon de 0 à 10 µmol de glucose (en suivant la procédure ci-dessous)
Effectuer une gamme étalon de 0 à 0,4 µmol de glucose
Effectuer 3 mesures pour chaque prélèvement
-ajouter la prise d ’essai
-ajouter de l’eau distillée qsp 1mL
-ajouter 2 mL de DNS
-Mélanger
-5 min au bain –marie bouillant
-refroidir
-ajouter 6mL d’eau distillée
-mesurer l’absorbance à 530 nm
Effectuer 3 mesures pour chaque prélèvement
-Effectuer une dilution approprié
-ajouter 0,2ml de substrat distillé
-ajouter 3,8 mL de réactif ninhydrine
-mélanger
-15 min au bain-marie bouillant
-refroidir
-mesurer l’absorbance à 570 nm
Ensemencement avec la souche sauvage
Ensemencement avec la souche Modifiée Lac Z
Mise en culture pendant 8 heures à 30°C avec agitation à 90 tours minutes
Préparer 25 mL de la solution de tampon Z : Na2HPO4 60mM
NaH2PO4 30mM
KCL 40mM
MgSO4.7H2O 1mM
Ajuster à pH 7
β-mercaptoéthanol 50mM
Préparer 10 mL de solution de Na2CO3 1M
-Pour chaque échantillon faire trois prises d’essai
Plus un blanc avec du tampon Z
-diluer la prise d’essai avec du tampon Z qsp 1mL
-ajouter 10µL de SDS 0,1% et 20 µL de Chloroforme sous la hotte (vortexer 15 secondes)
-attendre 5 minutes.
-ajouter 0,2 mL d’ONPG 4mg/mL ATTENTION noter l’heure de l’ajout
-Lorsqu’une coloration jaune –paille apparaît, stopper la réaction en ajoutant 0,5 mL de solution de Na2CO3 1M ATTENTION noter l’heure de l’ajout
-mesurer l’absorbance à 420 nm contre le blanc, et à 550 nm contre le blanc
LB LBCGXIII CGXIII CGXIII + leucine
CGXIII + Théobromine