03_LAURENT_IOA_26_11_2008
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Rôle du laboratoire de bactériologie dans le diagnostic des IOA du prélèvement … aux techniques moléculaires
Frédéric
LAURENT
Laboratoire
de Bactériologie
-
Hôpital
de la Croix Rousse
CNR des Staphylocoques
INSERM 851 –
Equipe
"Pathogénie
des Staphylocoques"
Trois acteurs majeurs dans la prise en charge bactériologique des IOA
Chirurgien orthopédiste / Pédiatre/ RhumatologueEvacuer
/ Nettoyer
Prélever
Microbiologiste
DétecterIdentifierMesurer la sensibilité
aux antibiotiques
Antibiothérapeute
Interpréter Choisir de l’antibiothérapie optimale
Points critiques pour le microbiologiste
•
Gestion des prélèvements
•
Conditions / Délais de cultures
•
Détection et identification de variants ou de souches différentes
•
Interprétation et rendu clair et cohérent des résultats qui puissent aider à
la décision thérapeutique
Difficultés rencontrées avec les IOA par le bactériologiste
•
Bactéries IOA = +/-
bactéries
de la flore cutanée
•
Infections plurimicrobiennes
•
Bactéries fragiles
•
Bactéries physiologiquement peu actives•
Antibiothérapie préalable au prélèvement
•
Bactéries cachées–
intracellulaires
–
biofilm
•
Bactéries normale (IOA aiguë) vs bactéries stressées (IOA chronique)
Contamination ou pas ?
Gestion des prélèvements +++
Cultures longuesMilieux richesMultiplicité
des milieux
Traitement adéquat des prélèvements
Expression phénotypique variée
Gestion des prélèvements
Eviter
toute contamination
Bactéries IOA = +/- bactéries de la flore cutanée
. nature du prélèvement. fistule, trajet de fistule = Se et Sp
médiocre
. biopsies tissulaires, pus, tissus per-op, liquide articulaire, synoviale, …
+++
. post-prélèvement. pots ou tubes secs stériles / seringue sans
aiguilles et closes
. Hotte PSM, gants stériles, matériel stérile et ou à
usage unique
Ensemencer dans les meilleurs délais
Bactéries fragiles
. transport rapide (<4 heures) / Portagerm®
ou équivalent / ensemencement au bloc ?. prévenir si arrivée tardive au laboratoire
Sélectionner les prélèvements …
pour IOA sur prothèseni trop
... ni trop peu
-
↑
risque contamination-
pb
gestion au laboratoire
. 15 minutes/prelts/technicienne
. matériel pour broyage
. identification/localisation-
taux positifs = critère d’interprétation
Spe
1+ / 5 à
7 prelts
26%2+ / 5 à
7 prelts
53%
3+ / 5 à
7 prelts
85%
Altweg, JSJB, 2003
Gestion des prélèvements
+ identification du patient, du service, du prescripteur, du prélèvement
Examen direct
Permettre éventuellement une orientation diagnostic rapide
. présence de bactéries et morphologie (sensibilité
faible) Gram, Ziehl, auramine
. présence d’une réaction cellulaire signant une infectioncoloration MGG : PNN, macrophagesNumération des éléments et formule pour liquide articulaire
Liquide articulaire sans prothèse
< 1 000 GB 5 000 - 60 000 GB/mm3 100 000 GB
< 20% PNN 50% PNN 60-80% PNN > 90%PNN > 90% PNN
Arthrose P R Cristaux Réactionnelle Cristaux Infection
Trauma Lupus Chlamydia, Yersinia, Salmonelle, Shigelle, Campylo, Neisseria,
Lyme………PCR
Infection
Algodystrophie Psoriasis
Mécanique Inflammatoire +/-
septique Septique
Mathews, Ann. Rheum
Dis., 2007
Examen direct
Permettre éventuellement une orientation diagnostic rapide
. présence de bactéries (sensibilité
faible) et morphologie Gram, Ziehl
, auramine
. présence d’une réaction cellulaire signant une infectionMGG (PNN, macrophages)Numération des éléments et formule pour liquide articulaire
Liquide articuliare
avec prothèse
Infection sur PTG Sensibilité Spécificité
GB > 1700 / mm3 94% 88%
PNN > 65% 97% 98%
** Trampuz, Am
J Med
, 2004sensibilité
= vrais (+), spécificité
= vrais (-)
X 2940
Mise en culture
4 hDébut de fabrication du "slime
"
8 h La surface du matériel est recouverte par une couche épaisse de "slime"
24 hDes bactéries émergent du biofilm, libres et prêtes à
se fixer ailleurs
OlsonOlson, et , et alal. J. . J. BiomedBiomed
Mater Mater ResRes
19881988
2 hFixation des S. aureus
sur des irrégularités à
la surface du matériel
Bactéries IOA = +/-
biofilm
/ intracellulaire
Présence de bactéries ? Lesquelles ? Quels sont les antibiotiques actifs ?
Cocci au fond d'une cassure d'une couche épaisse de biofilm d'un séquestre infecté
Evans et al., Clin Orthop. 1998, 243-249
X 2940
COCCI
Mise en cultureBactéries IOA = +/-
biofilm
/ intracellulaire
Mise en cultureBactéries IOA = +/-
biofilm
/ intracellulaire
Bactéries (points noirs) internalisées dans les ostéocytes entourés par des lamelles osseuses.
(Internalization
of S. aureus by osteoblasts
in a patient with
long term
recurrent
osteomyelitis
JBJS 2005)
X 1000
Mise en culture
Bactéries IOA = biofilm
/ intracellulaire
Bactéries IOA = très diverses
donc des bactéries aérobiesdes bactéries anaérobiesdes bactéries à
croissance rapide / lente
des bactéries classiques / des bactéries exigeantes/non cultivables
donc des bactéries cachées, engluées et adhérentesdes bactéries stresséesdes bactéries physiologiquement peu actives
Mise en culture
Recommandation Référentiel de Microbiologie REMIC 2007
–
Broyage avant ensemencement (merci de nous adresser des morceaux pas trop gros !!!)
. mortier/pilon, broyeur à
billes, …. sonication
(Trampuz, 2007 NEJM)
–
Cultures . prolongées
au moins 10 jours. en aérobiose et anaérobiose . sur géloses riches
sang et chocolat isovitalex
/ J1-J10. en bouillons d’enrichissement
J10 à
J21repiquage systématique des bouillons même si clairs +++
. en bouillons d’hémoculture pour liquides articulaires
+ recherche de mycobactéries pas systématique mais y penser (surtout si négatif)
Mise en culture
•
Gélose Sang aérobie + gélose chocolat CO2
(lecture à
J2)•
Gélose Sang anaérobie + gélose chocolat CO2
(lecture à
J10)•
Bouillon liquide (lecture jusqu’à
J21)
+ repiquage sytématique:. gélose sang anaérobie + gélose chocolat lecture CO2
. lecture
48h
Diagnostic bactériologiqueInfections aiguës à
espèces classiques
Bactéries " normales " • facile• ED +• réaction cellulaire ++• culture rapide
Infections chroniquesBactéries "stressées"
• ED –• Peu de PNN• culture lente >> 48 heures• populations d'aspects différents• perturbation de l'activité
des ATB
• antibiogrammes différents Staphylocoques à
coagulase
négative
S. aureus
J2J10
J2
J10
Interprétation des cultures
ou culture uniquement en bouillon liquide (sachant qu’un seul cocci ou un seul bacille suffit à positiver)
PolymorphismePolymicrobismeContamination
????
Aide : caractères biochimiques (galerie), génétique éventt
Interprétation des cultures
Infection polymicrobienne (>15% des cas)
•
Rare (1 colonie) Staphylococcus aureus culture positive en 24h
•
Quelques colonies de Staphylocoque à
coagulase
négative à
J4
•
Nombreuses petites colonies de P. acnes à J10
Interprétation des cultures
Souches Témoin
Electrophorèse Champs pulsés
Péni R
Genta S Genta R
Peflo S Peflo R Peflo I
Rif S Rif I Rif R
Fosfo S Fosfo I Fosfo S
2 morphologies 2 morphologies1 morphologie
Variation phénotypique de la morphologie et de la résistance
d ’un même S. aureus
Interprétation des cultures
Interprétation des cultures
Variants microcolonies
ou SCV "Small Colony
Variants"Faciles à
méconnaître :
•
décrits pour beaucoup d’espèces bactériennes (os, mucoviscidose)•
croissance lente
et culture retardée
•
colonies de petite taille•
perte pigmentation, perte d’hémolyse
•
auxotrophisme
(Hémine, Thymidine, ménadione...)•
métabolisme de l
’ATP profondément perturbé
•
forme de résistance des bactéries ?
Variants microcolonies
ou SCV
Même souche (génétiquement)En bas : normaleEn haut SCV
SCV
Particularités des micro-colonies in vitro:. adhérence +++. tps de génération (doublement) x 10. perte de l
’activité
bactéricide de certains ATB
. persistance des bactéries dans des niches cellulaires protectrices (Cellules endothéliales des vaisseaux, ostéoblastes, …)….
. peu de réaction inflammatoire locale
. à
l’origine d’échec thérapeutique
Infection polymicrobienne Infection chronique depuis 8 ans, PTH 4 changée fois
Cotyle et synoviale gauche (4 prélèvements):•
S. aureus : Péni R, S à
tout
•
S. epidermidis multi R
Fémur gauche (4 prélèvements) •
S. aureus : Péni R, S à
tout
•
S. epidermidis : 3 antibiogrammes différents (oxa
S/R, Genta
S/R, Ery
S/R, Fosfo S/R, Pef S/R, Rif S/R)
•
S. warneri : 2 antibiogrammes différents
Culture et identification
•
Isoler tous les aspects avec au moins:–
identification et antibiogramme sur les colonies différentes
–
sur au moins deux prélèvements différents (si possible)
Staphylocoques :. recherche systématique du gène mecA
(meti-R) ? (recommandations
CA-SFM). CMI Vanco
et Teico
systématique ?
•
Rendu des résultats
avec–
pour chaque prélevement
+ :
•
Nombre de milieux + et lesquels•
nombre de colonies / milieu
•
Antibiogramme(s)
–
synthèse type "Anapath"
Que faire des prélèvements restés stériles ?
10 à
50 % des IOA selon les séries et les contextes épidémio-cliniques
•
patient sous antibiotique (arrêt minimum 15 j)
•
prélèvement mal fait
•
transport trop long
•
culture inadéquate
•
bactérie trop fragile
•
espèce particulière et/ou méconnue ou non cultivable
•
mycobactérie
Comment améliorer le diagnostic ?
Un exemple : ostéo-arthrite de l’enfant et Kingella kingae
S. aureus
38K. kingae
25S. Pyogenes
4S. Agalactiae
3S. Pneumoniae
6H. influenzae
2Others
8
1+
Gélose sang12+
Flacon Hémoc
ana24+ Flacon Hémoc
aéro
Bilan Kingella kingaeCulture gélose 1/190Culture gélose + flacon hémoculture 25/190Culture gélose + flacon hémoculture + PCR 54/190
29 + 29 + 60
-
29
K. Kingae
N. meningitidis W13 (1)S. pyogenes (1)S. constellatus (1)S. aureus (1)Streptococcus spp. (1)Enterobacteria
(2)Pseudomonas spp. (1)
8 + 52 -
PCR Universel16SrDNA
89 des 104 prélèvements culture négative
PCR spécifiqueK. kingae
<4 ans >4 ans
190 prélèvements
Positif : 86 Negatif
: 104
Culture
Nouveaux outils
travail encore possible pour l’optimisation de conditions de culture (flacon d’hémoculture) et délais de mise en culture
biologie moléculairerapidité, sensibilité potentielle à optimiser +pas de miracle mais prometteurencore en phase d’évaluationnécessité de coordonner des études prospectives d’évaluation
. de la PCR universelle
. des PCR spécifiques
. des schémas diagnostiques optimisés stratifiés par groupe patients
pour l’instant : à
réserver quand culture –
et suspicion ++
Conclusion
•
Points clés–
gestion des prélèvements
–
conditions de cultures–
travail délicat et difficultés rencontrées
–
résultats échellonnés
parfois longs à
obtenir
•
Nouveaux outils–
amélioration des cultures
–
outils moléculaires