Un exemple de toxicologie mécanistique et systémique :

l’étude des mécanismes d’action de la dioxine.

X. Coumoul INSERM UMR-S 747

(Toxicologie, Pharmacologie et signalisation cellulaire)

Réponse spécifique adaptative

Métabolisme des xénobiotiques

Stress d’exposition aux xénobiotiques

Différentes réponses

Réponse générale adaptative

Contrôle du cycle cellulaire

Apoptose

Autres réponses

Voir plus loin

Chacune de ces réponses peut conduire à une toxicité

Xénobiotique

OH Phase I

CYP

Phase II

Phase III

O-Conj

O-Conj

Metabolisme des xénobiotiques (simplifié)

Dioxines

TetraChloroDibenzoDioxine: TCDD

- Famille de molécules plus ou moins chlorées - Planes, très lipophiles, très stables dans l’environnement et dans l’organisme

- Furanes: structure similaire mais 1 seul O - HAP: Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques (benzo(a)pyrène) - PCB: PolyChloroBiphényls - Propriétés similaires mais non identiques

Origine et transmission de la dioxine

- Origine industrielle: industrie chimique, papier, incinération d’ordures ménagères

- Contamination directe ou de la chaîne alimentaire (ex: viandes, poissons, produits laitiers: transmission par le lait de vache et le lait maternel) - Stockage dans le tissu adipeux - Demi-vie: 7 ans

Effets toxiques des dioxines sur l’animal et l’Homme

Toxicité chez l’animal

Etudiée principalement chez les rongeurs, plus récemment chez le singe - Reproduction et Développement: diminution de la fertilité, tératogénicité (fente palatine, organogenèse dentaire). Chez le singe: fœtotoxicité et endométriose - Effets anti-œstrogéniques - Effet cancérogène bien établi (cancérogène complet: initiateur &promoteur) - Immunosuppression - Toxicité aiguë: DL50 très variable selon les espèces

La dioxine est elle cancérogène chez l’homme?

Etudes épidémiologiques:

chez les travailleurs exposés (synthèse de produits chimiques chlorés)

chez les populations accidentellement contaminées (Seveso)

Augmentation significative mais modérée du risque (40%) pour

tous types de cancers (pas de localisation spécifique)

Pour Seveso, une tendance à l’augmentation a été observée

ces dernières années (plus de 20 ans après)

Autres effets chez l’homme

Dermatologiques: chloracné

Maladies cardiovasculaires et élévation des lipides sanguins

Diabète

Reproduction et Développement: nombreux effets rapportés selon les études (modification du “sex ratio”, diminution de fertilité, quelques malformations: émail dentaire).

• Effets observés y compris pour des expositions modérées. Confusion possible avec les PCBs.

Autres effets: données peu cohérentes

Caractéristiques des effets chez l’homme

• Pathologies diverses

• Cancers de localisations non spécifiques

• Facteur de risque modéré

• Dans certains cas, possibilité de confusion avec d’autres contaminants: PCB, Benzo(a)pyrène (tabac)

Le rôle de la dioxine est probable en raison des observations

chez l’animal:

Pathologies similaires à celles de l’homme

Rôle clair de la dioxine

Rôle du récepteur AhR

Quels mécanismes d’action ?

Les effets transcriptionnels de la dioxine

• Il existe un récepteur de haute affinité pour la dioxine et les HAP • Aryl hydrocarbon receptor (AhR) • La dioxine contrôle l’expression de nombreux gènes • Effet direct ou indirect du AhR • Les gènes des EMX sont les gènes cibles les mieux caractérisés • EMX: enzymes du métabolisme des xénobiotiques

• Le CYP1A1 (une EMX) est induit de manière précoce et puissante • Induction plus modérée pour d’autres cibles (CYP1B1 et CYP1A2)

• Problème: la dioxine est un très mauvais substrat de ces CYP (implications sur la demi-vie et toxicité)

bHLH PAS TAD TAD

Liaison ADN

Dimérisation

Transactivation

Liaison ligand

Structure similaire à d’autres facteurs transcriptionnels de

la famille PAS: HIF, Clock, Per, ARNT, Sim….

Structure du AhR

Dioxine

AhR ARNT AhR

AhR ARNT CYP1, EMX

O

O

Cl

Cl

Cl

Cl

Voie de transduction du AhR

XRE

XRE : Xenobiotic Responsive Element

Toxicité chez l’animal (suite)

Mécanismes:

- L’étude des souris déficientes en récepteur AhR montre:

Les effets géniques et la survenue de cancers et de malformations dépendent de ce récepteur

Ce récepteur a un rôle endogène: hépatique, thymique, fertilité, cardiovasculaire

- Il existe des différences de sensibilité des espèces animales qui ne sont pas simplement expliquées par le récepteur:

Rôle de la toxicocinétique

Autres mécanismes

Les effets transcriptionnels de la dioxine

• Il existe un récepteur de haute affinité pour la dioxine et les HAP • Aryl hydrocarbon receptor (AhR) • La dioxine contrôle l’expression de nombreux gènes • Effet direct ou indirect du AhR • Les gènes des EMX sont les gènes cibles les mieux caractérisés • EMX: enzymes du métabolisme des xénobiotiques

• Le CYP1A1 (une EMX) est induit de manière précoce et puissante • Induction plus modérée pour d’autres cibles (CYP1B1 et CYP1A2)

• Problème: la dioxine est un très mauvais substrat de ces CYP (implications sur la demi-vie et toxicité)

Ligands (dioxines, furanes, PCBs…)

AhR

Gène X Gène Y

CYP1A1

Gène Z

Effets directs

Effets indirects

Cascade transcriptionnelle

Les effets transcriptionnels de la dioxine

• Il existe un récepteur de haute affinité pour la dioxine et les HAP • Aryl hydrocarbon receptor (AhR) • La dioxine contrôle l’expression de nombreux gènes • Effet direct ou indirect du AhR • Les gènes des EMX sont les gènes cibles les mieux caractérisés • EMX: enzymes du métabolisme des xénobiotiques

• Le CYP1A1 (une EMX) est induit de manière précoce et puissante • Induction plus modérée pour d’autres cibles (CYP1B1 et CYP1A2)

• Problème: la dioxine est un très mauvais substrat de ces CYP (implications sur la demi-vie et toxicité)

Régulation de l’expression des gènes par la dioxine

1- Gènes du métabolisme des xénobiotiques:

phase I: CYP1A1, CYP1A2, C�YP1B1 phase II: NQO1, GSTA, UGT1A6, Aldh

2- Autres gènes: cytokines inflammatoires, facteurs de croissance,…

Les effets transcriptionnels de la dioxine

• Il existe un récepteur de haute affinité pour la dioxine et les HAP • Aryl hydrocarbon receptor (AhR) • La dioxine contrôle l’expression de nombreux gènes • Effet direct ou indirect du AhR • Les gènes des EMX sont les gènes cibles les mieux caractérisés • EMX: enzymes du métabolisme des xénobiotiques

• Le CYP1A1 (une EMX) est induit de manière précoce et puissante • Induction plus modérée pour d’autres cibles (CYP1B1 et CYP1A2)

• Problème: la dioxine est un très mauvais substrat de ces CYP

Comment expliquer la toxicité de la dioxine ?

Rôle des gènes cibles de AhR

Premières hypothèses:

le rôle du métabolisme des EMX

Balance entre protection & risque

Benzopyrène

CYP1A1

O

E.H.

HO

OH

CYP1A1 O

HO

OH

Diol-époxyde (mutagène)

GST GST UGT

Métabolisme du benzo(a)pyrene (BP)

.

Importance d’un bon équilibre entre les différentes EMX

BP iBPox

CYP1 EPH MPO

BPconj

GST UGT

Toxicité + +++ -

Un déséquilibre entre les activités des enzymes de phase I et de phase II conduit à une

accumulation d’intermédiaires très toxiques.

L’induction des CYP et des gènes de phases 2 par la dioxine active le métabolisme du BP

NQO1

Autre effet potentiel des EMX: Stress oxydant

CYP

XH XOH

O2 H2O

CYP

XH XH

O2 H2O2

Substrats découplés

Réaction catalytique optimale

L’induction des EMX ne peut pas expliquer l’ensemble des toxicités des ligands du AhR

Réponse spécifique adaptative

Métabolisme des xénobiotiques

Stress d’exposition aux xénobiotiques

Différentes réponses

Réponse générale adaptative

Contrôle du cycle cellulaire

Apoptose

Autres réponses

Métabolisme endogène

Migration

Chacune de ces réponses peut conduire à une toxicité

Omiques, …

Une thématique de l’équipe 1 de notre unité (INSERM UMR-S 747)

S’incrivent dans ces politiques générales de recherche -

Axées sur une meilleure compréhension des mécanismes d’action des xénobiotiques

Xénobiotiques Toxicités ?

Comment identifier de nouveaux gènes potentiellement responsables de toxicités ?

Systèmes haut-débit: omiques

Illustration d’un travail mené au laboratoire:

AhR et plasticité cellulaire

Historiquement: Dioxines

AhR

Autres gènes

? Transcriptomique

Gènes impliqués dans la migration et l’invasion cellulaire

EMX (CYP,…) Stress oxydant

Techniques - Culture cellulaire - Biologie moléculaire

Modèles - lignées humaines

AhR et plasticité cellulaire

HEF1, SOS1, AGR2,…

Morphologie cellulaire et dioxine

Diry et al, Oncogene 2006

MCF-7: cellule cancéreuse mammaire

Transition épithélio-mésenchymateuse

• E-Cadherine: marqueur épithélial membranaire • JNK: kinases activées par divers stress (EMT) • Rôles importants: développement, métastases

Progression tumorale ou dissemination métastatique

Morphologie cellulaire et dioxine

Diry et al, Oncogene 2006

Dioxine et mobilité cellulaire

Test d’adhésion Test de blessure

Dioxine et activation de JNK

T2.3: expression conditionnelle d’un récepteur AhR constitutivement actif

Rôle joué par le AhR dans ces phénomènes

Bui, Tomkiewicz et al, Oncogene 2009

Historiquement: Dioxines

AhR

Autres gènes

? Transcriptomique

Gènes impliqués dans la migration et l’invasion cellulaire

EMX (CYP,…) Stress oxydant

Techniques - Culture cellulaire - Biologie moléculaire

Modèles - lignées humaines

AhR et plasticité cellulaire

Identifiés dans la lignée HepG2 cellule cancéreuse hépatique

Gènes identifiés

INSERM UMR-S 747: gènes de la migration et de l’invasion

Gene Rôle de la protéine Induct° par dioxine

HEF1 Integrin signaling

Metastatic marker 5

AQP3 Aquaporin 10

SOS1 Regulation RAS/RAC 5

AGR2 ? 10

HEF-1 (Human enhancer of Filamentation) ou NEDD9

Structure

-protéine de la famille Cas

-Cas: Crk associated Substrate

-Isolé d’un « screening » effectuée chez la levure

Expression

- principalement dans lymphocyte, poumon, épithélium mammaire

- 2 formes principales 105 kDa et 115 kDa (forme hyperphosphorylée)

Rôle

- cycle cellulaire (fuseau mitotique, Aurora A)

- apoptose (inducteur ou marqueur ?)

- surexpression corrélée avec progression tumorale et invasion cellulaire (marqueur métastatique)

Cas: un relais pour les intégrines

Intégrines Milieu extrac.

Voies de signalisation

Relais

Régulation du gène HEF1 par la dioxine

Bui, Tomkiewicz et al, Oncogene 2009

La régulation de HEF1 par la dioxine dépend du AhR

Bui, Tomkiewicz et al, Oncogene 2009

Rôle de HEF1 dans les effets du AhR ?

Bui, Tomkiewicz et al, Oncogene 2009

Rôle de HEF1 dans les effets du AhR ? (2)

Bui, Tomkiewicz et al, Oncogene 2009

Rôle de HEF1 dans les effets du AhR ? (3)

Bui, Tomkiewicz et al, Oncogene 2009

Conclusion de cette étude

Dioxines & HAP AhR Migration & invasion ?

Morphology & Adhesion

E-Cadherin regulation

JN Kinase regulation

Cell migration

Epithelial Mesenchymal Transition (EMT) ?

Rôle de l’environnement progression tumorale ?

-La génomique (puces à ADN) a montré que la dioxine contrôle l’expression d’un grand nombre de gènes. Certains sont impliqués dans la motilité cellulaire: HEF-1, Sos-1, serpin-1, p27, MKP etc…

-Dans C. elegans, le récepteur AhR est impliqué dans la mobilité et la différentiation neuronale; chez la drosophile, Spineless (orthologue du AhR) est impliqué au cours du développement

- Problème de développement chez les souris AhR KO

- Problème de développement chez les souris AhR + TCDD

- Rôle de la régulation du AhR dans le développement (EMT ?) ?

Plasticité cellulaire et AhR

Quelques conclusions

Régulation des EMX par le AhR: n’explique pas toutes les toxicités

Apport des omiques dans la découverte de nouveaux rôles

Convergence avec d’autres études: exemples des KO

• souris (problème de développement)

• invertébrés (rôle du AhR dans le développement; Persistance d’une fonction ancestrale?)

Autres aspects intéressants du AhR:

• rôle différentiel des ligands

Expositions chroniques à faible dose

INSERM UMR-S 747 – Team 1

Team 1 Robert BAROUKI Chantal BENELLI

Xavier COUMOUL Toxicologie, métabolisme et signalisation cellulaire

M AGGERBECK - CR1 R BAROUKI - PUPH2 E BLANC - MCF B CHADEFAUX-VEKEMANS -MCUPH1 J-F CHASSE - MCUPH2 X COUMOUL - MCF M-A LE-FRERE BELDA – PH A-S BATS - PH F LECURU - PUPH2 C OTTOLENGHI - AHU H ROUACH - PR1 S SANQUER - PE C TOMKIEWICZ-RAULET –IE B LE-GRAND - TCH IE L-C BUI - POST-DOC M KIM - POST-DOC A AMBOLET-CAMOIT - PhD A CHEVALLIER - PhD E GUYOT - PhD S PIERRE - PhD

C BENELLI - CR1 C FOREST - DR2 J-L BRESSON - PUPH1 B DURANT - MCF M-JAUBERT - MCF S BORTOLI - IGR M COLLINET - AI G PENOT - POST-DOC F NIANG – PhD C PERRIERE – M2R

Merci de votre attention !!