REGULATION DE l’AMPkinaseREGULATION DE l’AMPkinase

Fabrizio AndreelliFabrizio Andreelli

CHU Bichat et INSERM U 695CHU Bichat et INSERM U 695

L’énergie…c’est la vie !!L’énergie…c’est la vie !!

Lipogenèse(nourri)

Lipolyse(à jeun)

TG alimentaires

AGL

TG

AGL + glycérol

Au moins deux phénomènes

Résistance à l’insuline Altération de l’insulinosécrétion

Un phénotype stéréotypé…

Production hépatique de glucoseStéatose hépatique

InsulinorésistanceLipolyse accrue

Insulinorésistance

AGLGlycérol

C.Tour de tailleC.Tour de taille

J Vague 1947

Lipotoxicité et TAV

TG

AGL

StéatoseMuscle

Cellule

AGLinsulinorésistance

insulinosécrétion

Nature 2006

Relations TAV et NASH

Greco AV et al. Diabetes 2002Greco AV et al. Diabetes 2002

Dépôts lipidiques extra-adipocytaires: muscle

NASH chez l’hommeNature 2006

Dépôts lipidiques extra-adipocytaires: foie

Jia MD et al, Diabetes 2000

Dépôts lipidiques extra-adipocytaires: beta cell

Rat OLEFT

Cancello R et al. Diabetes 2005

Miyazaki Y et al. AJP 2002

Syndrome métabolique

Tour de taille mesuréTour de taille mesuré

En position debout et en expiration douceEn position debout et en expiration douce

A mi-hauteur entreA mi-hauteur entre

rebord costal inférieurrebord costal inférieur crête iliaquecrête iliaque

d’après Lean (1995)d’après Lean (1995)

Risque élevéRisque élevéRisqueRisque

102 cm102 cm 94 cm94 cmHommeHomme

88 cm88 cm 80 cm80 cmFemme Femme

Obésité - répartitionObésité - répartition

Conséquences du syndrome métabolique

Insulinorésistance Diabète de type 2Sd métabolique

Risque cardio-vasculaire

Intra-abdominal adiposity and glucose metabolism

Pouliot et al 1992

IAA: intra-abdominal adipositySignificantly different from 1non-obese, 2obese with low intra-abdominal adiposity levels

Time (min) Time (min)

1

1

11

11,2

11

1mm

ol/

L

0

3

6

9

12

15

0 60 120 180

1,2

0

400

800

1200

1,2

1,2

1,2 1,2

1,21,2

1,2

1,2

1

Are

a

1,2

Are

a

0 60 120 180

pm

ol/

L

InsulinGlucose

Non-obese Obese low IAA Obese high IAA

AGL

Tissu adipeuxabdominal

AMPKinaseChangements métaboliques

Effets enzymatiques

Effets géniques

Environnement hormonal

regulatory SU

regulatory SU

catalytic SU

Structure de l'AMP-kinaseStructure de l'AMP-kinase

1, 1, 22

1, 1, 2, 2, 33

N488I R531GT400NH383RR302Q

R225Q mutation 3

mutations 2

1, 1, 22

AMPK

Catalytic domain binding

N C

N C

N C

bindingGlycogen binding

AMP/ATP binding

CBS1 CBS2

AMPK kinase

CBS3 CBS4

Thr172

Catalyticsubunit

Regulatorysubunit

Structure of AMP-activated protein kinaseStructure of AMP-activated protein kinase

LKB1CaMKK

AMP is signal of energy depletionAMP is signal of energy depletion

fatty acid oxidation

fatty acid synthesis

ATPAdenylate kinase

ADP ATP

physical exercise

• ischemia• hypoxia

AMP

AMP

AMP

AMP

AMP

ATP

ADP

LKB1LKB1CaMKKCaMKK

Pi

H2O

PhosphatasesPhosphatases

AMP

AMP

AMP

AMPKAMPK

ATP

ATP-generation

ADP

ADP

ATP-consuming

= -AMPK

Regulation of AMP-activated protein kinaseRegulation of AMP-activated protein kinase• glucose deprivation• metabolic poisons AMP/ATPAMP/ATP

Regulation of AMP-activated protein kinaseRegulation of AMP-activated protein kinase

CBS4

T172

CBS4

AMPKK

AMPAMP: Catalytic subunit

: Scaffold/glycogen-binding

: Regulatory (AMP-binding)

AMPAMP ATP ATP

P

LKB1

CaMKKinactiveAMPK

activeAMPK

InsulineInsulinePP

IRS-1IRS-1

PI-3 kinase

GlucoseGlucose GlucoseGlucose

Glut4Glut4

Ox

Stockage

AMPK+

AICAR

Bergeron R et al. AJP 1999

Bergeron R et al. Diabetes 2001

Le traitement de rongeur par AICARLe traitement de rongeur par AICAR

-augmente la captation intramusculaire de glucose même-augmente la captation intramusculaire de glucose mêmeen présence d’une insulinorésistanceen présence d’une insulinorésistance

*rongeur sain*rongeur sain*rongeur obèse*rongeur obèse

Winder WW. J Appl Physiol 2001

Mu J et al. Mol Cell 2001

Mu J et al. Mol Cell 2001

Mu J et al. 2003

La réduction spécifique de l’activité de l’AMPK dans les muscles

-s’associe à une diminution de la captation de glucose contraction dépendante

-réduit la synthèse de glycogène

-altère sa re-synthèse post-exercice physique

-n’altère pas la signalisation de l’insuline musculaire

-n’altère pas la sensibilité à l’insuline in vivo ni la glycémie

Les mutations activatrices des sous-unités de l’AMPK

entraînent une accumulation de glycogène intramusculaire

(muscle squelettique 3 et cœur 2) et participent à la physiopathologie

des syndromes de pré-excitation cardiaque (WPW).

Arad M et al. Circulation 2003

L’activation de l’AMPK musculaire par la contraction ou l’AICARaugmente la synthèse de glycogène musculaire

Les mutations activatrices de l’AMPK dans le muscle ou le cœur provoquent l’accumulation de glycogène et favorisent des troubles deconduction

Le traitement de rongeur par AICARLe traitement de rongeur par AICAR

-augmente la captation intramusculaire de glucose-augmente la captation intramusculaire de glucose

-réduit la production hépatique de glucose et la stéatose hépatique-réduit la production hépatique de glucose et la stéatose hépatique

*rongeur sain*rongeur sain*rongeur obèse*rongeur obèse

Bergeron R et al. Diabetes 2001

Zhou G et al. J Clin Invest 2001

FFAFFA

Acyl-CoAAcyl-CoA

Malonyl-CoAMalonyl-CoA

Acétyl-CoAAcétyl-CoA

CPT-1

-Oxydation-Oxydation

Acétyl-CoAAcétyl-CoA

GlucoseGlucose

Glucose-6PGlucose-6P

PyruvatePyruvate

CitrateCitrateKrebsKrebs

FFAFFA

Acétyl-CoA carboxylaseAcétyl-CoA carboxylase(ACC)(ACC)

AMPKAMPK

MetformineMetformine

+

-

L’activation pharmacologique de l’AMPK L’activation pharmacologique de l’AMPK

-augmente la captation intramusculaire de glucose-augmente la captation intramusculaire de glucose

-réduit la production hépatique de glucose-réduit la production hépatique de glucose

-réduit la lipogenèse hépatique-réduit la lipogenèse hépatique

*rongeur sain*rongeur sain*rongeur obèse*rongeur obèse

Intérêt thérapeutique dans le diabète de type 2 !!

AMPK1-/-

AMPK2-/-

Phenotypic analysis of AMPK KO micePhenotypic analysis of AMPK KO mice

AMPKAMPK1-/- AMPK1-/- AMPK2-/- KO is embryonic lethal2-/- KO is embryonic lethal

LoxP LoxP

+ CRERecombinase

Activity in vitro

- without DNA replication- without topo activity- without cofactors

+

+ CRECRE = Recombinase from bactériophage P1Recombinase from bactériophage P1

LoxP = 34bp sequence34bp sequence

DNADNA

Cre-loxP Strategy

x

mice harbouring a complete inactivation of 2

CREEIIApromoter( zygote)

Total inactivation of 2 AMPK

muscleliver

+/+ -/- +/+ -/-

1 KO1 KO

+/+ -/- +/+ -/-

muscleliver

2 KO2 KO

AMPK1

AMPK2

Characterization of AMPK KO miceCharacterization of AMPK KO mice

2 wt

2 ko

+/- +/+ -/-+/- +/+

1 wt1 ko

-/-

AMPK1

AMPK2

Western blotWestern blot

Southern blotSouthern blot

Western blotWestern blot

Southern blotSouthern blot

Jorgensen, JBC2004Jorgensen, JBC2004 Viollet, JCI2003Viollet, JCI2003

E9.5 dpc

Control 1-/- 2-/-

Alive no morphological differences

E11.5 dpcDead morphological aspect

of E10.5

1 KO -> embryonic lethality around 10.5 dpc.

AMPK complexes play an essential role during embryonic development.

                                                                                          

AMPK2-/- mice are not obeseAMPK2-/- mice are not obese

0

10

20

30

40

body

wei

ght

(g)

+/+ -/-

Body weight

0

2

4

6

8

%of

fat

mas

s

+/+ -/-

% of fat mass

Foo

d in

take

(g/

d))

+/+ -/-

Food intake

0

1

2

3

4

F Andreelli, J Clin Invest 2001

Glucose tolerance test in AMPK KO miceGlucose tolerance test in AMPK KO mice

time (min)

50

100

150

200

250

300

350

glu

cose

(m

g/dl

)

0 20 40 60 80 100 120

AMPKAMPK1-/-1-/-control

1 KO1 KO

100

120

140

160

180

200

220

0 20 40 60 80 100 120

time (min)

*

***

glu

cose

(m

g/d

l)

2 KO2 KOcontrol

AMPKAMPK2-/-2-/-

+/+ -/-0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0

0,1

0,2

0,3*

+/+ -/-

InsulinemiaInsulinemiaat 20min (ng:ml)at 20min (ng:ml)

InsulinemiaInsulinemiaat 20min (ng:ml)at 20min (ng:ml)

F Andreelli, J Clin Invest 2001

-20

0

20

40

60

80

100

120

Glucose TO HGP Glycolysis Gln Synthesis

controlAMPK2 -/-

****

****

Metabolic parameters during euglycemic hyperinsulinemic clamp in AMPK2-/- mice

Metabolic parameters during euglycemic hyperinsulinemic clamp in AMPK2-/- mice

F Andreelli, J Clin Invest 2001

controlAMPK2-/-

0

100

200

300

400

500

600

700

800

Gln synthesis

****

0

0,25

0,5

Total Gln content

**

Muscle glycogen during clamp in AMPK2-/- miceMuscle glycogen during clamp in AMPK2-/- mice

F Andreelli, J Clin Invest 2001

100

120

140

160

180

200

220

0 20 40 60 80 100 120 time (min)

*

***

glu

cose

(m

g/d

l)

controlAMPKAMPK2-/-2-/-

0

0,1

0,2

0,3*

+/+-/-

InsulinemiaInsulinemiaat 20min (ng:ml)at 20min (ng:ml)

-20

0

20

40

60

80

100

120

Glucose TO HGP Glycolysis Gln Synthesis

controlAMPK2 -/-

****

****

Metabolic parameters during euglycemichyperinsulinemic clamp in AMPK2-/- mice

Metabolic parameters during euglycemichyperinsulinemic clamp in AMPK2-/- mice

F Andreelli, J Clin Invest 2001

controlAMPK2-/-

0

100

200

300

400

500

600

700

800

Gln synthesis

****

0

0,25

0,5

Total Gln content

**

Muscle glycogen during clamp in AMPK2-/- miceMuscle glycogen during clamp in AMPK2-/- mice

F Andreelli, J Clin Invest 2001

F Andreelli, J Clin Invest 2001

In vitro glucose transport in AMPK2-/- muscleIn vitro glucose transport in AMPK2-/- muscleD

eoxy

gluc

ose

tran

spor

t (µ

mol

/g/h

)

0

0,5

1

1,5

2

2,5

basal insulin+/+

SoleusSoleus

0

0,5

1

1,5

EDLEDL

basal insulin-/-

Deo

xygl

ucos

e tr

ansp

ort

(µm

ol/g

/h)

+/+ -/- +/+ -/- +/+ -/-

F Andreelli, J Clin Invest 2001

Insulin content per islet is similar: 67.2 16.2 ng/islet (AMPK2-/-) versus 63.9 16.5 ng/islet (control)

In vitro glucose-stimulated insulin secretionIn vitro glucose-stimulated insulin secretion

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

insu

lin

rele

ase

as %

con

tent

0 15 30 45 60 75 90 105 120

Time (min)

7.5 10 20 10

L-Arg

3 3 3 3 3 mM glucose

AMPK2-/-

control

F Andreelli, J Clin Invest 2001

AMPK2-/- mice do not present:- hypokaliemia- hyperleptinemia- increased TG content in pancreas

Why are AMPK2-/- mice insulinopenic? Why are AMPK2-/- mice insulinopenic?

modification of sympathetic and parasympathetic balance activity?

Urinary catecholamine levels in AMPK2-/- miceUrinary catecholamine levels in AMPK2-/- mice

0

10

20

30

40

50

**

urin

ary

epin

ephr

ine

(ng/

d)

0

10

20

30

40

50*

urin

ary

dopa

min

e (n

g/d)

0

500

1000

1500

2000

2500

**

uri n

ary

nore

p ine

phri

ne

(µg/

d)

epinephrineepinephrine norepinephrinenorepinephrinedopaminedopamine

+/+ -/- +/+ -/-+/+ -/-

F Andreelli, J Clin Invest 2001

-adrenergic antagonist treatment of AMPK2-/-mice-adrenergic antagonist treatment of AMPK2-/-mice

Glucose tolerance testGlucose tolerance testGlucose tolerance testGlucose tolerance test

0

50

100

150

200

250

300

0 20 40 60

Time (min)

0

50

100

150

200

250

300

0 20 40 60

Time (min)

***

**

% o

f ba

sal g

luco

se

% o

f ba

sal g

luco

se

saline phentolaminecontrol

saline phentolamineAMPK2-/-

F Andreelli, J Clin Invest 2001

use of AMPK-DN mice expressing a dominant use of AMPK-DN mice expressing a dominant inhibitory mutant of AMPK in skeletal muscle.inhibitory mutant of AMPK in skeletal muscle.

(Mu et al., 2001)(Mu et al., 2001)

Is impaired glycogen synthesis linked to the lack of AMPK activity in skeletal muscle?

Is impaired glycogen synthesis linked to the lack of AMPK activity in skeletal muscle?

creatine kinase promoter AMPK-DN

Glucose tolerance testGlucose tolerance test

0

100

200

300

400

500

-30 0 30 90time (min)

Glucose tolerance in AMPK-DN miceGlucose tolerance in AMPK-DN mice

60

AMPK-DN

seru

m g

luco

se (

mg/

dl)

control

Alpha 2-AMPK KO mice are insulin resistant--> In vivo insulin stimulated glycogen synthesis is reduced

AMPK DNmuscle

+-

Glycogen synthesis rateng/min.mg

Control

+0

Insulin

100

50

-AMPK KOAlpha 2

+-

*

Insulin resistance is not due to lack of muscle AMPK

Altered regulation of metabolism in AMPK2-/- miceAltered regulation of metabolism in AMPK2-/- mice

glucoseinsulin

high sympathetic tonehigh sympathetic tone

glycogen synthesisglycogen synthesis

catecholaminecatecholamine

insulininsulin

F Andreelli, J Clin Invest 2001

Rôle essentiel de la sous-unité alpha 2 dans les actions métaboliques de

l’AMPK.

AMPK2-/- mice exhibit increased body weight

• Increased body weight in AMPK2-/- with no changes in food intake

Diabetes 2004

Increased adipose tissue mass in AMPK2-/- mice

• a 40% increase in total fat pad mass weight of AMPK2-/- mice

Diabetes 2004

Diabetes 2004Diabetes 2004

La délétion de la sous-unité alpha 2 de l’AMPK dans tous les tissus altère la sensibilité à l’insuline et prédispose

à l’obésité.

Intérêt en génétique humaine ?

Quid de l’effet tissu-spécifique de l’AMPK ?

KO alpha 2 spécifique du foie

Liver 2 KOAMPK1

AMPK2

WT liver 2

CREAlbuminpromoter

2flox x

Liver 2 KO

wt

deleted

floxed

fl/f

l; c

re-

l

iver

+/+

; cre

+

liv

er

fl/f

l; c

re+

l

iver

fl/f

l; c

re+

p

ancr

eas

fl/f

l; c

re+

h

ypot

hala

mus

fl/f

l; c

re+

a

dipo

se ti

ssue

fl/f

l; c

re+

m

uscl

e

fl/f

l; c

re+

l

iver

Andreelli F et al, Endocrinology 2006

Liver 2 KO viablefertile

AMPK1

AMPK2

WT Liver 2

CREAlbuminpromoter

2flox x

Liver 2 KO

liver

F Andreelli, Endocrinology, soumis

Insulinemia t40

0

0,2

0,4

0,6

0,8

ng/ml

2A2B

Control

Liver2KO

0

100

200

300

400

0 20 40 60Time (min)

glu

cose

(m

g/dl

)

*

***

**

F Andreelli, Endocrinology, soumis

3A

Control

Liver2KO

basal clamp

0

20

40

60

80

EGP EGP GlucoseTurnover

mg/

kg/m

in

*

3B

p-Akt

PB

S

INS

INS

INS

PB

S

INS

INS

INS

Control Liver2KO

total Akt

F Andreelli, Endocrinology, soumisPEPCK

0

2

4

6

8

10

G6Pase

5

*

Enz

ymat

icac

tivi

ty(U

/ g t

issu

e) 12

14

*

Control

Liver2KO

16

F Andreelli, Endocrinology, soumisAndreelli F et al, Endocrinology 2006 Andreelli F et al, Endocrinology 2006

Andreelli F et al, Endocrinology 2006Andreelli F et al, Endocrinology 2006

Régulation hormonale de la PHG

Insuline

Adiponectine

Leptine

Néoglucogenèse

-

-

Table adiponectine

Andreelli F et al, Endocrinology 2006

Pas de conséquence sur la signalisation de l’insulinePerte du contrôle de la PHG par la leptine et l’adiponectine

AMPKalpha 2AMPKalpha 2

LeptineLeptineAdiponectineAdiponectine

+

Néoglucogenèse

Insuline

Surexpression de l’AMPkinase

Adenovirusinjection1.109 pfu

Sacrifice48h infection

Expression of AMPK2-CA by in vivo adenovirus-mediated gene transfer in mice

Expression of AMPK2-CA by in vivo adenovirus-mediated gene transfer in mice

Adenovirus AMPK2-CA+

analysis of gene expression in fasted/refed conditions

effect on glycemia

Diabetes 2005

-> injection of adenovirus expressing constitutively active AMPK in control and diabetic mouse models

CA-AMPK

0

50

100

150

200

250

§§

Blo

od G

luco

se (

mg/

dl)

fasted glucosefasted glucose

§§

wt ob/ob

§

300

STZ

Rel

ativ

e m

RN

A L

evel

1.2

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

§§

§§

§

PEPCK mRNAPEPCK mRNA

wt ob/ob STZ

Liver AMPK targeting is sufficient to control glycemia in diabetic mice.

Ad -galAd CA-AMPK

Diabetes 2005

FFAFFA

Acyl-CoAAcyl-CoA

Malonyl-CoAMalonyl-CoA

Acétyl-CoAAcétyl-CoA

CPT-1

-Oxydation-Oxydation

Acétyl-CoAAcétyl-CoA

GlucoseGlucose

Glucose-6PGlucose-6P

PyruvatePyruvate

CitrateCitrateKrebsKrebs

FFAFFA

Acétyl-CoA carboxylaseAcétyl-CoA carboxylase(ACC)(ACC)

AMPKAMPK

LeptineLeptineAdiponectineAdiponectineMetformineMetformine

TZDsTZDs

+

-

Patti ME, Kahn BB. Nature Medicine 2004

Rôle essentiel de la sous-unité alpha 2 de l’AMPK dans les actions

métaboliques. Rôle de la SU alpha 1 ?

AMPK1 KO mice are anemicAMPK1 KO mice are anemic

0

2

4

6

8

10

12

RBC (106/ml)

***

+/+ -/-0

10

20

30

40

50

60

-/-+/+

Ht (%)

***

0

4

8

12

16

20

-/-+/+

Hb (g/dl)

***

0

4

8

12

16

20

Hb (g/dl)

+/+ -/-0

2

4

6

8

10

12

RBC (106/ml)

-/-+/+

1 KO1 KO

2 KO2 KO

0

10

20

30

40

50

60

-/-+/+

Ht (%)

0

200

400

600

800

1000

1200***

iron

(µ

g/g

)

+/+ -/-

Splenomegaly in AMPK1 KO miceSplenomegaly in AMPK1 KO mice

control AMPK1-/-

Expression of AMPK1 isoform in RBCExpression of AMPK1 isoform in RBC

AMPK1

AMPK2

control 1-/- 2-/-

Exclusive expression of AMPK1 isoform in RBC= specific role for AMPK1 in RBC integrity.

ATP utilization in RBC

Glucose phosphorylation

Phosphorylation of membrane proteins

Ionic pumps

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

ATP

*

ATP content in AMPK1 -/- RBCATP content in AMPK1 -/- RBC

+/+ -/-

brain

AMPKAMPK

Liver

muscle

heart red blood cells

adipose tissue

hepatic glucose productionhepatic glucose productionfatty acid metabolismfatty acid metabolism

cardiac ischemiacardiac ischemia

glucose transportglucose transportglycogen synthesisglycogen synthesis

lipolysislipolysis

food intakefood intakeinsulin sensitivityinsulin sensitivity

ion transportion transport

AMPK2 AMPK1

Institut Cochin, ParisInstitut Cochin, ParisInstitut Cochin, ParisInstitut Cochin, Paris

Viollet BenoitMarc Foretz

Myriam BennounClaire Cheret

Axel KahnSophie Vaulont

Copenhagen Muscle Copenhagen Muscle Research CenterResearch Center

Copenhagen Muscle Copenhagen Muscle Research CenterResearch Center

University of ToulouseUniversity of ToulouseUniversity of ToulouseUniversity of Toulouse

Christophe PerrinRémy Burcelin

Sebastian B. JørgensenJørgen F.P. Wojtaszewski

Erik A. Richter

Howard Hughes Howard Hughes Medical InstituteMedical Institute

Howard Hughes Howard Hughes Medical InstituteMedical Institute

Morris J. BirnbaumJames Mu

Les Thiazolidinediones

Moller DE et al, Int J Obes 2003 Wilson TM et al, Ann Rev Biochem 2001