Post on 03-Apr-2015
Master "Ingénierie pour la Santé"
Option "Ingénierie Médicale"
Sophie PINELLaboratoire d’Histopathologie Expérimentale et Moléculaire – EA 4001
Faculté de Médecine, Bât D 1er étage9 avenue de la Forêt de Haye
54505 VANDIEUVRE LES NANCYTél : 03.83.68.32.04.
Email : pinel.sophie@tiscali.fr
Culture de cellules animales
INTRODUCTION GENERALE
Modèles d’études en biologie animale (≠ biologie végétale)
Organe isolé
Cellules en culture
Fractions cellulaires isolées (Fractions subcellulaires, macromolécules)
Organisme entier
Homme
Animal
COMPLEXITE+ -
Environnement artificiel pour croissance et/ou fonction
Homogénéité
Relations intersystèmes
Liens intercellulaires normaux rompus
CULTURE DE CELLULES ANIMALES
1. DIFFERENTS TYPES DE CULTURES CELLULAIRES
1.1. Méthodes d’obtention des cellules cultivées
Isolement à partir d’un liquide ou d’un tissu biologique
Achat auprès d’un organisme certifié
American Type Culture Collection (ATCC)European Collection of Cell Cultures (ECACC)
Monoclonal avec caractéristiques définies, qualité contrôlée mais onéreux
Echanges entre laboratoires
Qualité non garantie : risques de contamination ++
CULTURE DE CELLULES ANIMALES
1.2. Cultures primaires – Cultures secondaires
1.2.1. Cultures primaires
Isolement à partir d’un organe ou d’un tissu Cellules adhérentes
Culture d’explants
Après quelques joursFragment d’organe/de tissu
Milieu de culture adapté
Dissociation mécanique et enzymatique
Action mécanique (broyer, émincer)Action d’enzymes protéolytiques (trypsine, collagénase) Suspension cellulaire
Mise en culture
Plusieurs types cellulaires (fibroblastes dominants)
Purifier pour système monoclonal
Méthodes de clonage
Méthodes de séparation physique (centrifugation sur gradient de densité, chromatographie d’affinité, cytométrie de flux, électrophorèse, séparation par billes magnétiques)
Sang : lymphocytes, cellules leucémiques
Liquide pleural, liquide d’ascite : cellules tumorales
Cellules circulantesIsolement à partir d’un liquide biologique
Centrifugation sur gradient de densité, ou trieur de cellule
1.2.2. Cultures secondaires
Cultures établies par repiquage successifs de cellules déjà mises en culture (cultures primaires ou secondaires, cellules achetées, …)
CULTURE DE CELLULES ANIMALES
1.3. Cultures finies – Cultures continues
1.3.1. Cultures finies
1.3.2. Cultures continues
Après X repiquages (env. 30 à 60 mitoses/divisions), division cellulaire stoppée, mort cellulaire par apoptose
Cultures cellulaires à durée de vie limitée
Cellules en cultures capables de se diviser indéfiniment
Cellules somatiques issues de tissus normaux
Cellules ayant des propriétés d’IMMORTALITE
Immortalité innée : cellules souches
Immortalité acquise : CELLULES TRANSFORMEES
= cellules tumorales
Cultures primaires puis secondaires à partir d’une tumeur animale ou humaine
Cultures primaires puis secondaires à partir d’un tissu normal : transformation in vitro (agents chimiques, radiations, virus)
(+) : Culture illimitée dans le temps, manipulation plus facile et croissance plus rapide( -) : instabilité génomique, pertes des propriétés morphologiques et fonctionnelles initiales
CULTURE DE CELLULES ANIMALES
1.4. Cellules adhérentes – Cellules en suspension
1.4.1. Cellules adhérentes
Dépendance vis-à-vis de l’ancrage= Nécessité d’être attachées entre elles et ancrées sur un support pour survivre
Cultures en monocouche
Cultures tridimentionnelles = sphéroïdes
Ensemencement dans des boîtes de culture : les cellules adhèrent au fond, puis se divisent, se placent les une à côté des autres jusqu’à former un tapis cellulaire.
Cellules mises en culture en suspension dans le milieu et maintenues sous agitation lente afin de favoriser l’accrochage des cellules entre elles: formation d’amas sphériques au sein desquels les cellules se divisent
Boîte de Pétri, Flacon de culture, Plaques multipuits
Spinner
Cellules issues de tissus normaux, la plupart des cellules issues de tumeurs solides.
CULTURE DE CELLULES ANIMALES
1.4.2. Cellules en suspension
Indépendance vis-à-vis de l’ancrage
Ex : Cellules issues du sang, cellules leucémiques
Cellules mises en culture en suspension dans le milieu de culture (avec ou sans agitation) et se multiplient ainsi
Boîte de Pétri, Flacon de culture, Plaques multipuits
1.4. Cellules adhérentes – Cellules en suspension (suite)
Remarque :
Récipients en verre
Récipients en plastique +/- pré-traitement
Systèmes matriciels simulant la matrice extracellulaire
CULTURE DE CELLULES ANIMALES
1.5. Types cellulaires cultivés
Identification par rapport au système dont les cellules dérivent
Caractéristiques morphologiques
Caractéristiques fonctionnelles +/- conservées
Cellules de type lymphoblastique
Cellules de type épithélialAncrage indispensable, polygonales, et aplaties, très serrées
Cellules de type fibroblastiqueAncrage indispensable, allongées et bipolaires, filaments
Cellules de type endothélialAncrage indispensable, polygonales, petite taille
Cellules de type neuronalAncrage indispensable, un corps central et départ de dendrites
En suspension, forme sphérique
Rque : Influence des conditions de culture
CULTURE DE CELLULES ANIMALES
Hybridomes
Cellules hybrides obtenues par fusion de deux cellules appartenant à des types différents mais apparentés
Intérêt : Combiner les propriétés des 2 types cellulaires
Ex : Lymphocyte issu de la rate capable de produire un anticorps défini+
Cellules de myélome se divisant très rapidement et possédant la machinerie pour produire des anticorps mais l’utilisant pas
=Hybridome capable de produire un très grande quantité de l’anticorps désiré
Intérêt industriel, diagnostique et clinique
1.5. Types cellulaires cultivés (suite)
CULTURE DE CELLULES ANIMALES
2. CROISSANCE DES CELLULES EN CULTURE IN VITRO
1 : phase de latence, 2 : phase de croissance exponentielle, 3 : phase de ralentissement, 4 : phase stationnaire, 5 : phase de déclin.
2.2. Les différentes phases de la croissance
2.1. Le repiquage des cultures cellulaires
Lavage du tapis cellulaire (PBS)
Détachement des cellules par action enzymatique (trypsine, collagénase à 4° ou à 37°C)
CULTURE DE CELLULES ANIMALES
2.3. Cryoconservation des cellules
Cellules peuvent être congelées
Éviter les passages trop nombreux = vieillissement de la population cellulairePermet d’interrompre l’activité
Azote liquide
Cryoconservateur : DMSO, glycérol
Descente progressive en température
CULTURE DE CELLULES ANIMALES
3. CONDITIONS ET DIFFICULTES DE LA CULTURE CELLULAIRE
3.1. Eviter les contaminations
3.1.1. Contaminations chimiques
3.1.2. Contaminations biologiques
Endotoxines, résidus plastiques, ions métalliques, traces d’agents nettoyants/désinfectants, etc…
Effets invisibles, produits difficiles à détecter
Levures, bactéries, champignons
Effets généralement visibles, facile à détecter
Modification du pH et de la turbidité du milieu
Virus, mycoplasme
Effets invisibles, détection possible par analyse spécifique
Détection de mycoplasme : marquage de l’ADN des cellules avec du Hoechst
Négatif Positif
CULTURE DE CELLULES ANIMALES
3.1.3. Moyens de lutte contre les contaminations
Environnement et surfaces propres
Consommable utilisé adapté (fournisseur certifié)
Equipement, récipients plastiques et verre propres et stérilisés
Milieux de culture stériles
Maintenir la stérilité des cultures et des milieux
HOTTE A FLUX LAMINAIRE VERTICALou
POSTE DE SECURITE MICROBIOLOGIQUE
Filtre HEPA (high efficiency particule air)
Lampe UV
Protection des cultures, milieux, plastiques
Protection de l’environnement
Protection du manipulateur (vitre à l’avant))
Air ambiant
Air contaminé
Air stérile
Usage d’antibiotiques, d’antifongiques
CULTURE DE CELLULES ANIMALES
3.2. Trouver les conditions de culture optimales
3.2.1. Critères de jugement
Environnement optimal
les cellules ne meurent pas
les cellules se divisent
les cellules reproduisent in vitro les fonctions physiologiques ou biochimiques connues in vivo
obligatoires
Les critères d’évaluation
Viabilité cellulaire
Taux de croissance
Morphologie
Efficacité d’ensemencement (dilution de la culture et formation de colonie)
Expression de fonctions spécifiques
Microscope en phase inversée, bleu trypan, numération à l’hémocytomètre
CULTURE DE CELLULES ANIMALES
3.2. Trouver les conditions de culture optimales (suite)
3.2.2. Paramètres de l’environnement à contrôler
Le milieu de culture
Milieux complexes qui doivent apporter tous les éléments nutritifs nécessaires à la croissance/prolifération des cellules animales
Eau
Ions minéraux nombreux et variés en concentration adéquate (Na+, K+, Cl-,HCO3-, H2PO4
2-)
Source de carbone et d’énergie : le plus souvent glucose
Eléments de constitution : acide aminés essentiels +/- non essentiels, + glutamine acides gras, cholestérol, vitamines + cofacteurs, riboses et désoxyribose
Antibiotiques +/- antifongiques : pénicilline G, streptomycine, +/- amphotéricine B
Facteurs de croissances divers(FGF, EGF, PDGF, IL-2, etc…)
Sérum de veau fœtal (1,5 à 10%) décomplémenté
Les paramètres physico-chimiques
Température : 37°C
GAZ : O2 et CO2
Osmolarité avoisinant celle du sérum physiologique (300 mOsm/L)
Rôle des ions, contrôle les mouvements d’eau et de substances entre milieux extra et intra-cellulaire
pH compris entre 7,0 et 7,4 En particulier HCO3-/CO2, système tampon
Hygrométrie : 80% d’humidité Eviter évaporation du milieu
INCUBATEUR A CO2Contrôle de la température, hygrométrie, 5% de CO2
CULTURE DE CELLULES ANIMALES
4. DOMAINES D’APPLICATION
Culture cellulaire = Outil majeur en biologie animale
4.1. Modèle d’étude
Etude des propriétés biologiques et biochimiques des cellules
Etude des liens entre les causes d’une maladie/anomalie et ses répercussions sur la cellule
Etude des effets d’un agent chimique sur les cellules
Etude du processus de vieillissement cellulaire +/- comment interagir
Etude nutritionnelle
4.2. Support aux tests de toxicité
Etude des conséquences toxiques d’un nouvel agents chimiques, cosmétiques, pharmaceutiques
En aval des essais chez les animaux
Cellules hépatiques et rénales
4.3. Recherche en cancérologie
Différence entre cellules normales et tumorales
Etude des agents transformants = cancérigènes
Screening de nouveaux médicaments anticancéreux
CULTURE DE CELLULES ANIMALES
4.4. Virologie
Etude de la réplication et des propriétés des virus .
Etude des mécanismes d’infection par les virus
Etude de l’efficacité des antiviraux
4.5. Applications industrielles
Production d’anticorps monoclonaux (diagnostic, clinique, recherche)
Production de protéines de synthèse (insuline, facteur de croissance)
Production de virus en grande quantité pour préparation des vaccins
Production de tissus de substitution : thérapie cellulaire (cornée, peau) +/- essais !!!
4.6. Etudes génétiques
Analyses diagnostiques sur le caryotype, les chromosomes, l’ADN
4.7. Génie génétique, thérapie cellulaire et thérapie génique
Réintroduction de gènes fonctionnels dans les cellules à visée thérapeutique
Introduction de gènes dans les cellules pour en modifier les propriétés d’expression (recherche, application clinique ?)