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Laboratoire d’Etude du Métabolisme des Médicaments, DSV/iBiTec-S/SPI
Christophe Junot
CEA/Laboratoire d’Etude du Métabolisme des MédicamentsCEA-Saclay (iBiTec-S)
christophe.junot@cea.fr
La spectrométrie de masse pour la détection, lacaractérisation et la quantification des biomoléculesdans les fluides biologiques
Laboratoire d’Etude du Métabolisme des Médicaments, DSV/iBiTec-S/SPI
The huge complexity of biological media
Laboratoire d’Etude du Métabolisme des Médicaments, DSV/iBiTec-S/SPI
Biomolecules occur at a wide concentration range
(Adapted from Sumner L.W. et al., 2003)
mM
Concentration range
µM
nM
pM
Glucose
Citric acid
Amino-acids
Hormones
NeurotransmittersProstanoids
NMR
GC/MS
LC/MS
LC/Fluo
Laboratoire d’Etude du Métabolisme des Médicaments, DSV/iBiTec-S/SPI
Analytical chemistry for biological sciences
Detection Quantification Structural analysis
Laboratoire d’Etude du Métabolisme des Médicaments, DSV/iBiTec-S/SPI
La spectrométrie de masse: détecter et identifier des molécules par mesurede leur masse
Source Analyseur(s) Détecteur Traitement du signal
Production d’ions en phase gazeuse
Séparation des ions selon leur rapport m/z
Conversion d’un courant ionique en courant électrique
100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
288.2531
179.1068
147.1126114.0912
135.0910
159.0676119.0831
234.0970167.0830196.6413
183.0779
265.1116227.1752 244.2270281.0650
Laboratoire d’Etude du Métabolisme des Médicaments, DSV/iBiTec-S/SPI
What is mass spectrometry ?
Source
Analyser(s)
Detector
direct introductionGaschromatography Liquid chromatography
Atmospheric pressure ionizationElectrospray (ESI), APCI, APPIElectron impact
Chemical ionization
Low resolution:TQ (triple quadripole)IT (ion trap)
High resolution:TOF (time of flight)FT-ICR (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance)OrbitrapTM
Laboratoire d’Etude du Métabolisme des Médicaments, DSV/iBiTec-S/SPI
Accès à la masse moléculaireAnalyse des molécules thermolabilesCouplages LC/MS
Spectrométrie de masse à source à ionisation à pression atmosphérique
[M+H]+
[M-H]-
Laboratoire d’Etude du Métabolisme des Médicaments, DSV/iBiTec-S/SPI
Différents types d’analyseurs pour des applications variées
Pièges ioniques (mode MSn)
- Analyses structurales
50 100 150 200m/z
1,8
0,0
0,5
1,0
1,5
100
0
20
40
60
80
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
120,9
79,8
121,981,3200,758,9 137,1
105,9
urine de rats 02_030131142846#696 RT: 29,47 AV: 1 NL: 7,96E5 F: - p d Full ms2 200,97@35,00 [ 45,00-415,00]
urine de rats 02_030131142846#706 RT: 29,93 AV: 1 NL: 1,41E4 F: - p d Full ms3 200,97@35,00 120,91@35,00 [ 20,00-250,00]
50 100 150 200m/z
1,8
0,0
0,5
1,0
1,5
100
0
20
40
60
80
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
120,9
79,8
121,981,3200,758,9 137,1
105,9
urine de rats 02_030131142846#696 RT: 29,47 AV: 1 NL: 7,96E5 F: - p d Full ms2 200,97@35,00 [ 45,00-415,00]
urine de rats 02_030131142846#706 RT: 29,93 AV: 1 NL: 1,41E4 F: - p d Full ms3 200,97@35,00 120,91@35,00 [ 20,00-250,00]
MS2
MS3
OS
O
O
OH m/z 121
m/z 80
m/z 106
Analyseurs à haute et ultra-haute résolution (TOF, Orbitrap, FTICR)
Triples quadripôles (MS/MS)
- Quantification sensible et spécifique - Analyse sélective de familles chimiques
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MS à haute résolution: détecter plus de métabolites et les identifier plus facilement
Résolution en masse
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
999.00 1000.0 1001.0 1002.0m/z
R=3000
m/z
FWHM: R = (m/z)/( m/z)1.0000
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
999.00 1000.0 1001.0 1002.0m/z
R=1400 0.9885
C10H15O4 (0.1 ppm)
Databases
Précision en masse
Mais attention aux isomères!!
Urines humaines
38 métabolites détectés en conditions C18correspondent à 83 métabolites en conditions PFPP
(Roux et al., Anal. Chem., 2012)
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Les principales difficultés à surmonter en analyse quantitative par spectrométrie de masse
• sensibilité
• Effet matrice: diminution du rendementd’ionisation du à la présencede substances co-éluées.
MRM1MRM2
Composés endogènesinvisibles
• Spécificité:
dGTPC10H16N5O13P3
ATPC10H16N5O13P3
RT: 0.00 - 10.02 SM: 7G
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Time (min)
0
20
40
60
80
100
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
0
20
40
60
80
100
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
RT: 4.86MA: 5548515
5.721.34 6.630.17 9.807.85 8.673.992.08 2.73RT: 4.86MA: 1119001
5.68 5.944.550.82 7.591.60 2.17 3.47 8.20 9.28
dGTP
ATP
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Sample preparation
Sophisticated sample preparation improves detection sensitivityat the expense of biomolecules coverage
Solid phase extraction
Liquid-liquidextractionSolvent/acid
precipitation
To clean-up samples and/or to concentrate metabolites
Sample preparation depends on the kind of biological medium investigated and on the kind of biomolecules of interest. Cell extracts, tissue extracts, biofluidsQuenching issue
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La validation des méthodes LC/MS pour laquantification de médicaments dans les milieuxbiologiques
- Rendement d’extraction
- Rendement d’ionisation
- Effet mémoire
- Linéarité
- Limite de détection, limite de quantification approximative
- Précision et exactitude (intra- et inter-série)
- Stabilité (dans les conditions d’analyse et dans les conditions de
conservation)
- Effet des anticoagulants (pour les dosages plasmatiques)
Bien décrit (Shah et al., 1992, 2000 ; FDA, 2001…)
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Metabolite-profiling for studying the regulation of the glutathione biosynthesis pathway in S. Cerevisiae
Cystathionine Cysteine
S-Adenosyl-Homocysteine
Oxidized glutathione
Homocysteine
-Glutamyl-Cysteine
Reduced glutathione
Methionine
S-Adenosyl-
Methionine
Cys4
Cys3
Str2
Gsh1
Gsh2
Sam1
Sam2
Met6
Str3
Sulfate assimilation
Glr1
Sah1
METHYLCYCLE
Previous proteomic results
showed that Cadmium stongly
increases GSH synthesis, which is
used for the detoxication process.
(Vido et al., 2001)
How is it regulated ?Are there any limiting enzymes ?
To develop an analytical method for the simultaneous quantification of the metabolites involved in the biosynthesis of GSH
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(Lafaye et al.,Anal Chem 2005)
LC-ESI-MS/MS combined with 15N metabolic labelingof S.cerevisiae
14 N culture to be analyzed
15 N culture
14 N extract
15 N referenceextract
METABOLITE EXTRACTION
MIXING OF ALIQUOTS
LC- MS /MS ANALYSIS OF THE MIXTURE
14N/15N isotope ratio
QUANTITATIVERESULTS
N signals
14 metabolite
14 N referencecompounds
CONSTRUCTION OFCALIBRATION CURVES
0 25 50 75 100 1250
1
2
3
4
Concentration (µg/mL)
14N
/15N
rat
io
MS2collision cell
MRM: MULTIPLE REACTION MONITORING
MS1
Laboratoire d’Etude du Métabolisme des Médicaments, DSV/iBiTec-S/SPI
Cys 4
Cys 3
Gsh 1
Gsh 2
Met 6
Sulfate Cysteine
0 2 4 60.00
0.25
0.50
0.75
16 20 24
Time (h)
Con
cent
ratio
n(m
M)
Homocysteine
0 2 4 60
50
100
150
16 20 24
Time (h)
Con
cent
ratio
n(µ
M)
Methionine
0 2 4 60.00
0.25
0.50
0.75
1.00
16 20 24
Time (h)
Conc
entr
atio
n(m
M)
Cystathionine
0 2 4 60.0
0.5
1.0
1.5
2.0
16 20 24
Time (h)
Con
cent
ratio
n(m
M)
-Glutamyl-Cysteine
0 2 4 60.0
2.5
5.0
7.5
16 20 24
Time (h)
Con
cent
ratio
n(m
M)
S-Adenosyl-Homocysteine
0 2 4 60
100
200
300
16 20 24
Time (h)
Con
cent
ratio
n(µ
M)
Total Glutathione
0 2 4 60
5
10
15
20
16 20 24
Time (h)
Con
cent
ratio
n(m
M)Sam1
Sam2
Sah1
(Lafaye et al., J.Biol.Chem. 2005)
Laboratoire d’Etude du Métabolisme des Médicaments, DSV/iBiTec-S/SPI
Basic principle of quantitative mass spectrometry for proteins
Mass filtering approach with standard technologies
Triple quadrupole OrbitrapMaldi-Tof
8+
7+
6+
5+
4+8+
7+
6+
5+
4+8+
7+
6+
5+
4+8+
7+
6+
5+
4+
1. Whole protein
2. Digested protein (peptides)
Laboratoire d’Etude du Métabolisme des Médicaments, DSV/iBiTec-S/SPI
Internalstandard
Trypsination and analysisof peptides by LCMS/MS
F: \ 0101 2 8\ 080 40 8 \0 8040 8 007 0 8/0 4/ 2008 2 0: 55: 5 1 A pel in 12 1 0ng/ m L SI 10 ng /m L
0
1 0
2 0
3 0
4 0
5 0
6 0
7 0
8 0
9 0
1 00
Relat
ive
Abu
ndan
ce
3 56 . 449 84
35 6. 700 53
35 9. 4 56 59
35 9.7 0 73 2
356 .9 5 10 4
359. 9 57 74357 . 20 1 48 3 59 . 20 581 3 60. 20 79 3
3 57. 45 20 5 358 .2 572 73 56 . 449 84
N L: 3 . 93E 5
08 040 800 7#5 7 7- 59 0
R T: 5 . 10- 5. 21 A V: 14 T : F TM S + p E S I
F ull m s [ 140 .0 0- 900 .0 0 ]
N L: 3 . 93E 5
Elution
Digestion
LC/MS quantificationin MRM mode
RT: 3.15 - 7.15 SM: 7G
3.5 4.0 4. 5 5.0 5.5 6.0 6.5 7. 0Time (min)
0102030405060708090
1 00
01020304050
60708090
1 00
Rela
tive A
bund
ance
RT: 5.15BP: 356.4500 1
RT: 5.15BP: 359.4567 9
NL:5.44E5m/z= 356.44435-356.45509 MS 08040800 7
NL:3.62E5m/z= 359.45097-359.46192 MS 08040800 7
Extraction by solid-phaseBound target (VEGFR)
ProteinAntibody (rabbit IgG)
IS Elution
Digestion
(Dubois et al, Anal. Chem., 2008)
Quantification of a therapeutic antibody (Erbitux) using LC/MS/MS in human serum
Erbitux(146 kDa)
LOQ=20 ng/ml
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Les approches globales «omiques»
Les gènesLe génome
génomiquepolymorphisme
Les ARN messagersLe transcriptome
transcritomique
Les métabolitesLe métabolome
métabolomique
Les protéinesLe protéome
protéomique
GENOTYPE PHENOTYPE
Laboratoire d’Etude du Métabolisme des Médicaments, DSV/iBiTec-S/SPI
Déroulement d’une analyse métabolomique
-4000
-3000
-2000
-1000
0
1000
2000
3000
4000
-4000 -3000 -2000 -1000 0 1000 2000 3000 4000
t[2]O
t[1]P
TEMOINSMALADES
PREPARATION DES ECHANTILONS
ACQUISITION DES EMPREINTES TRAITEMENT DES DONNEES
IDENTIFICATION DES BIOMARQUEURSCONFIRMATION ET QUANTIFICATION
ECH.
VAR
IAB
LES
(RT-
MA
SSES
)
EXTRACTION
DILUTION…
UR INE 3 0D IL4_ C ID 2 0_e ndo gèn es #6 8 R T : 1.22 AV: 1 NL: 4 .1 7E 5F : F TM S + p E S I Fu ll m s 2 173 .0 9@ c id2 0.00 [50.00 -800 .0 0]
60 8 0 100 12 0 140 16 0 1 80m /z
05
1 0
1 52 0
2 53 03 5
4 04 5
5 0
5 56 0
6 57 07 5
8 08 5
9 09 5
1 00
Rel
ativ
e A
bund
ance
1 16.07 041
17 3.091 901 27.08 652
1 55.08 1368 0.494 587 0.064 97 1 69.67 42686 .0 640 018 4.862 1861 .0 399 0 1 02.71 753 143 .0 416 7
-H2O
[M+H]+-HCOOH
-C2H3ON
BASES DES DONNEES, MS/MS …
DETECTION AUTOMATIQUE DES SIGNAUX
DETECTION AUTOMATIQUE DES SIGNAUX
Laboratoire d’Etude du Métabolisme des Médicaments, DSV/iBiTec-S/SPI
Détection automatique des signaux
1. Alignement des variables en temps de rétention et en mesures de masses2. Suppression du bruit de fond3. Détection et mesure des pics4. Présentation des données sous forme matricielle
Echantillons
Varia
bles
(Rt-m
asse
)
Laboratoire d’Etude du Métabolisme des Médicaments, DSV/iBiTec-S/SPI
Few thousands of variables…
…Few hundreds of metabolites ??
Annotation of peak lists is requiredto help for metabolite identification
0 20 40 60 80 100 120 140Time (min)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
Samples
Varia
bles
(Rt-m
ass)
?????????0 20 40 60 80 100 120 140
Time (min)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
0 20 40 60 80 100 120 140Time (min)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
Chemical and biochemical databases: KEGG (www.genome.jp/kegg), Metlin (www.metlin.scripps.edu), HMDB (www.hmdb.ca)
spectral databases
Laboratoire d’Etude du Métabolisme des Médicaments, DSV/iBiTec-S/SPI
Pourquoi une base de données spectrale ?
Annotations (HMDB, KEGG, METLIN)Deethylatrazine 3-amino-2-naphthoic acid Indoleacrylic acid
189.0757 5.28 C10[13C]H10NO2 Tryptophan [(M+H)-(NH3)]+ (13C) Ethyl Oxalacetate190.0787 5.28 C9[13C]2H10NO2 Tryptophan [(M+H)-(NH3)]+ (13C2)
TryptophanethotoinVasicinolIdazoxanNirvanolN-Acetyl-D-fucosamineN-Acetyl-D-quinovosamine
207.1051 5.28 C9[13C]2H13N2O2 Tryptophan [(M+H)]+ (13C2)Gly Trp Phe (and isomers)Lys Met Met (and isomers)Tyr Leu Asp (and isomers)Ile Tyr Asp (and isomers) Val Tyr Glu (and isomers)
410.1938
AttributionCompoundFormulaRTM/Z
[(2M+H)]+ (13C)TryptophanC21[13C]H25N4O45.28
[(2M+H)]+TryptophanC22H25N4O45.28409.1902
205.0975
[(M+H)]+ (13C)TryptophanC10[13C]H13N2O25.28206.1010
[(M+H)]+TryptophanC11H13N2O25.28
[(M+H)-(NH3)]+TryptophanC11H10NO25.28188.0709
Extraction des ions : liste de variables annotésePic d’intérêt
Une molécule = plusieurs ions = redondance du signal
(Thèse Aurélie Roux 2008-2011)
Laboratoire d’Etude du Métabolisme des Médicaments, DSV/iBiTec-S/SPI
Metabolomics for the characterization of metabolites in complex biofluids
Experimental design:
– 20 rats per groups
– Rats administered with phenobarbital(PB) for 4 days (i.p injections)
– Urines collected: 16hours fractions
– 2 time points: D-3 (PD: pre-dose) and D5(PT=post-treatment)
The aim: to discover some biomarkers for enzyme (CYP 450) induction
(Erwan Werner PhD work)
Laboratoire d’Etude du Métabolisme des Médicaments, DSV/iBiTec-S/SPI
1 00
2 00
3 00
4 00
5 00
6 00
7 00
8 00
-1 0 00 0 1 00 0
t[2]O
t[1]P
PD
PT
1 00
2 00
3 00
4 00
5 00
6 00
7 00
8 00
-1 0 00 0 1 00 0
t[2]O
t[1]P
PD
PT
Principal Component Analysis(ACP)
• Unsupervised analysis• To evaluate the structure of the data set
Orthogonal Projection to Latent Structures (OPLS)
D-3D5
Component 1(Inter-Class)
Com
pone
nt2
(Intr
a-C
lass
)• Supervised analysis• To improve the clustering• To focus on a particular effect• To sort variables
Laboratoire d’Etude du Métabolisme des Médicaments, DSV/iBiTec-S/SPI
-0.6
-0.4
-0.2
-0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
-0.06 -0.05 -0.04 -0.03 -0.02 -0.01 -0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08
p(co
rr)[1
]P
w*c[1]P
(OPLS)w*c[Comp. 1]/p(corr)[Comp. 1]
SIMCA-P 11 - 18/12/2006 10:16:35
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
1200
1300
PD
-01
PD
-02
PD
-03
PD
-04
PD
-05
PD
-06
PD
-07
PD
-08
PD
-09
PD
-10
PD
-11
PD
-12
PD
-13
PD
-14
PD
-15
PD
-16
PD
-17
PD
-18
PD
-19
PT-
01
PT-
02P
T-03
PT-
04P
T-05
PT-
06P
T-07
PT-
08P
T-09
PT-
10P
T-11
PT-
12P
T-13
PT-
14
PT-
15
PT-
16
PT-
17
PT-
18
PT-
19
XVar
(231
.084
7_17
.768
)
Obs ID (Primary)
dataservier-neutre-neg.M6 (OPLS)XVar(231.0847_17.768)
SIMCA-P 11 - 18/12/2006 10:16:10
D-3 D+5
D-3 D+5
OPLS loadings: S-plot
UPLC-TOF :2458 extracted variables(suppression of isotopes) SIMCA P11:
628 variables modified by PB42 variables related to PB
m/z 247
Laboratoire d’Etude du Métabolisme des Médicaments, DSV/iBiTec-S/SPI
•MS- molecular formula
•MS²- Add-on removal
•MS3
- highlights PB substructure (Werner et al., Analytical Chemistry, 2008)
OrbitrapOrbitrap®
LTQ
Laboratoire d’Etude du Métabolisme des Médicaments, DSV/iBiTec-S/SPI
Overview of identified metabolites
(Werner et al., Analytical Chemistry, 2008)
Laboratoire d’Etude du Métabolisme des Médicaments, DSV/iBiTec-S/SPI
Conclusion-perspectives
La spectrométrie de masse est un outil polyvalent et performant pour l’analyse des biomolécules dans les milieux biologiques.
Le futur: miniaturisation, gérer la complexité: couplage à d’autre techniques séparatives
(mobilité ionique)La spectrométrie de masse au pied du malade???
(Schäfer KC, Anal. Chem., 2012)
Laboratoire d’Etude du Métabolisme des Médicaments, DSV/iBiTec-S/SPI
RemerciementsCEA/LEMMJean-François HeilierAlexandra LafayeCéline DucruixErwan WernerGeoffrey MadalinskiEmmanuel GodatJérôme CottonYing XuAurélie RouxEric EzanBenoit ColschSamia Boudah
CEA/iRCMPaul-Henri RoméoDhouha DarghouthBérengère KoehlMarie-Françoise Olivier
G.H. Pitié-SalpétrièreFrédéric SedelMaria del Mar AmadorFanny MochelFoudil Lamari
Laboratoire de Chimie Structurale Organique et Biologique (UPMC)Jean-Claude Tabet, Richard ColeDenis Lesage, Sandra AlvesEstelle Paris, Baiyie Xu
Groupe de Chimie Analytique de Paris Sud,EA 4041 (Université Paris 11)Pierre Chaminade
CEA/DRT/LIST/DETECSOlivier Gal, Antoine Souloumiac, Etienne Thévenot, Jean-Pierre Both
CEA/Programmes Transversaaux de Technologies pour la santé et Tox NucJacques Grassi, Marie-Thérèse Ménager
CEA/iBiTecJean Labarre, Franck et Corinne Chauvat, Michel Toledano
Laboratoire d’Etude du Métabolisme des Médicaments, DSV/iBiTec-S/SPI
Glu-Phe
×
× ×
×
×××
×
×
×
×
××
×
Glutamate
CSF metabotype of a Dihydropteridinereductase (DHPR) deficient patient
Autosomal recessive genetic disorder. Hyperphenylalaninemia due to tetrahydrobiopterinedeficiency (malfunctioning Tyr and Trphydroxylases)
no change
not detected×
increased concentrations
Phenylalanine metabolism
Tryptophanmetabolism
Medication
Miscellaneous
(Coll. Dr. F. Sedel, G.H. Pitié-Salpétrière)
Laboratoire d’Etude du Métabolisme des Médicaments, DSV/iBiTec-S/SPI
But (!!!...) : Require specific reagents (Anti idiotype, soluble targets….)
Are susceptible to matrix interferences which may lead to variable results
Immunoassays for protein quantification• Are routinely applied• Are sensitive (20 to 500 ng/ml) and easy to perform
Laboratoire d’Etude du Métabolisme des Médicaments, DSV/iBiTec-S/SPI
nM
µM
pM
Global approaches
1-10 10-100 100-1000
Targetedapproaches
Number of analyzed compounds
High Resolution MS
Triple quadrupole instruments (MRM mode)
Relative quantification
Absolute quantification
0 20 40 60 80 100 120 140Time (min)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Rel
ativ
e A
bund
ance