Guide des bonnes pratiques

Martine Doco-Fenzy, Damien Sanlaville et le groupe qualité

Guides des bonnes pratiques CGH array

Objectif : établir une v1.0

Historique Point de départ :

Articles de la littérature ISCN 2005 ISO 15189 …

Ebauche d’un document Discussion mail au sein du groupe qualité Envoie à tout le réseau du document de

travail

Terminologie CGH array Caryotype moléculaire HGC sur micro réseau d’ADN …

Introduction La technique de CGH array est une

technique d’analyse globale du génome offrant un niveau de résolution bien supérieur à celui du caryotype pour la détection d’anomalies déséquilibrées et le terme de caryotype moléculaire a été proposé pour désigner ces nouvelles techniques d’analyse du génome.

Introduction Le caryotype moléculaire regroupe l’ensemble

des techniques permettant une analyse globale du génome sur des micro-array. Ces techniques sont basées sur les homologies de séquence ADN, permettant l'identification d’un déséquilibre en perte ou gain de tout ou partie d'une ou plusieurs régions génomiques.

Proposition ?

Réglementation2. LOIS ET DECRETS DE REFERENCE2.1. Textes généraux2.2. Agréments et autorisations2 .2.1 Cytogénétique constitutionnelle2.2.2 Génétique moléculaire2.3. Dispositif sur les « caractéristiques génétiques » de

la personne3. DIPLOMES DE CYTOGENETIQUE ou de

GENETIQUE MOLECULAIRE3.1. Diplômes de Cytogénétique 3.2. Diplômes de génétique Moléculaire

Echantillons biologiques

Echantillons biologiques Il revient au prescripteur de décider si

l’analyse en CGH-array est indiquée mais le responsable du laboratoire garde la maîtrise du type de puce à utiliser en fonction de l’indication et des procédures en vigueur dans le laboratoire.

Echantillons biologiques Les échantillons seront accompagnés d'une

fiche de prescription mentionnant le motif de la demande et le diagnostic suspecté, l'identification du médecin prescripteur, des renseignements cliniques spécifiques susceptibles de déterminer le choix des techniques à mettre en oeuvre et permettant une interprétation optimale des résultats.

Si ceux-ci ne peuvent pas être pas obtenus, le compte rendu du résultat devra le mentionner.

Réalisation de la CGH array

Réalisation de la CGH array Spécifications tissulaires Le laboratoire devra déterminer les

critères d’évaluation pour déterminer les seuils normaux et anormaux pour chaque type tissulaire, reconnaissant que la sensibilité de l’analyse, peut être différente pour chacun.

Réalisation de la CGH array L’ADN témoin Le résultat de chaque nouvel ADN contrôle doit être

comparé aux résultats obtenus avec le précédent (au minimum sur 1 analyse). Les CNVs de l’ADN de référence utilisé doivent être référencés dans le laboratoire.

Le laboratoire peut choisir de ne pas utiliser un ADN de référence par exemple en utilisant une approche en trio ou quatuor entre patients. Le plan de l’expérience devra veiller à coupler des patients avec des phénotypes différents.

Réalisation de la CGH array Choix expérimental Les contrôles en sexe-opposé (sex

mismatch) donnent une anomalie construite qui est intéressante pour établir la qualité de la technique de microarray à travers l’établissement de différence de dosage entre le chromosome X et le Y.

Cependant pour les anomalies des gonosomes, ou de la ploïdie il est préférable de réaliser des analyses en sexe identique et opposé ou de confirmer par FISH ou caryotype.

Réalisation de la CGH array Analyse des données Il est nécessaire de vérifier que les

critères qualité de l’image obtenue pas le scanner sont compatibles avec une bonne interprétation des ratios de fluorescence (Par exemple : intensités globale, rapport signal/bruit,….)

Proposer des critères qualités pour les différents type de plate forme ?

Exemple

Exemple % de saturation

% d’hybridation (>95 pour BACs/PAC) Signal/ BDF >4 pour l’ensemble des signaux Signal/ BDF >1,5 par spot Duplicons résultats identiques SD : (< 0,096: BACs) log ratio log2 : 0,57 (+/- 3DS)

Spot déviant des limites normales de ≥ 2 et ≤ -0,8 vérifié sur les deux subbarray dye-swap (concordance de l’anomalie)

Qualité du Flag du spot Sex-mismatch: segment des X > 0,6 % d’inclusion (des spots validés analytiquement) > 90% pour chaque

subarray, ou >99% pour les deux ensemble Déviation Standard : lame propre 0,03 à 0,05 ; normale 0,05 à 0,08 ;

bruitée 0,08 à 0,1 Nombre de spots dépassant les limites normales de ≥ 2 et ≤ 0,8 et

nécessitant une validation par FISH/qPCR (min 1 spot anormal)

Eviter une liste et proposer que le laboratoire choisisse quelques paramètres

Exemple En pratique, quelques critères seront a

référencer dans la cadre du CQI du laboratoire.

Il s’agira de critères de suivi de la plateforme afin de repérer une éventuelle dérive et s’assurer de la bonne qualité technique.

Ex : DLRS, niveau de bruit de fond,…

Réalisation de la CGH array Interprétation Valeurs des log2ratio seuil

Perte Gain Ampli Normal

Le laboratoire définira les critères qui lui permettent de retenir un CNV. Par exemple pour une puce Agilent : 3 oligonucléotides contigus avec des log2ratios évoquant une perte ou gain.

Les mosaïques Déterminer la sensibilité de la

plateforme à dépister une mosaïque …

La limite de sensibilité devra être notée dans le CR (Shaffer)

Réalisation de la CGH array Interprétation Les praticiens doivent avoir connaissance de

l’existence de CNVs « bénins » ; décrit comme polymorphes ; et de CNVs de signification phénotypique inconnue. Ils pourront s’aider des données de la littérature et des bases de données existantes comme la Database of Genomic Variants pour leur analyse.

Réalisation de la CGH array Interprétation Il est souhaitable/nécessaire d’évaluer la

taille du remaniement, ses bornes et les gènes présents (en particulier, les gènes déjà impliqués en pathologies, gène « OMIM »). La taille du remaniement sera un élément important pour la conclusion (perte ou gain).

Notion de gène

Réalisation de la CGH array Interprétation Proposition des critères de Lee Autres critères P r o p o s e r l e s

critères de Miller

AJHG 2010

Réalisation de la CGH array Condition d’utilisation La technique de CGH-array pan-génomique est une

technique complémentaire du caryotype, et doit être utilisée comme telle, sauf indications particulières.

Elle pourra être utilisée en première intention devant certaines indications comme le retard mental associé ou non à un syndrome malformatif.

Les résultats devront être contrôlés par une technique complémentaire de référence et dont le laboratoire à l’expérience.

Réalisation de la CGH array Validation Le praticien devra avoir une formation

suffisante en CGH array. Par exemple en ayant participé à l’analyse, l’interprétation et le rendu de 50 analyses de CGH array.

CQI

CQI ADN témoin Matériel Réactifs Test de la plate forme

Les méthodes de validation doivent être documentées dans le laboratoire

ADN témoin Répertorier les CNVs : méthodes de

validation

Contrôles lors de l’introduction d’un nouvel ADN témoin?

Matériel Scanner : 1 calibrage par an ? Dépend des fournisseurs ? Autres matériels ?

Réactifs validation des nouvelles puces par des

ADNs avec anomalies chromosomiques connues, (un minimum de 5 anomalies différentes : perte terminale et interstitielle, gains terminal et interstitiel et anomalie gonosomique)

Le laboratoire devrait échanger 5 échantillons en aveugle normaux et anormaux avec un autre laboratoire de référence (Shaffer).

30 Shaffer

Réactifs validation des évolutions de puces par des

ADNs avec anomalies chromosomiques connues, (un minimum de 5 anomalies différentes : perte terminale et interstitielle, gains terminal et interstitiel et anomalie gonosomique)

Le laboratoire devrait échanger 5 échantillons en aveugle normaux et anormaux avec un autre laboratoire de référence (Shaffer).

Shaffer : et 2 ADN normaux.

Réactifs Shaffer : Pour tout changement de lot

de réactifs : valider en réalisant une CGH array avec un ADN passé dans les anciennes conditions

Non retenu…

Contraintes importantes

Décision ?

Test de la plate forme Faire des hybridation en self/self

Combien / Fréquence ? Hybrider plusieurs fois le même patient :

reproductibilité ?

Pas de précision dans le document actuel : à définir

Dossier patient

Rien de particulier 5.3.1 Images ou tableaux représentatifs des résultats obtenus Des images ou tableaux représentatifs des résultats obtenus doivent

être conservés 5.3.2 Contenu du dossier patient : Discrétion nécessaire par rapport au dossier patient partagé. 5.3.2.1Données patient / puce : •Données administratives (Nom, Prénom, DN) •Echantillon: date de prélèvement, date de réception, type échantillon,

N°ADN, N°famille(option) •Type puce (Bluegnome, Agilent, Affymétrix,…) •Prescription et nom du prescripteur •Consentement O/N, caryotype O/N •Indication/clinique •Nom des parents, indiquer si prélèvement disponible (a discuter)

Plus spécifique 5.3.2.2 Données techniques: •Traçabilité des étapes techniques (feuille de

travail, tableau ID ADN , critères de qualité (photo gel) quantité (nanodrop +/- qubit ou autre bioanalyseur), marquage )

5.3.2.3 Résultats brut puce (scan lame) 5.3.2.4 Résultat patient interprétation •ID patient, N° lame, type lame, type échantillon,

anomalie (chr, del/dup, loc cyto, début/fin nt, syndrome associé, clone, AQ, validation FISH/QPCR),

•polymorphismes identifiés (tableau type Excel avec anomalies sur un onglet/CNV sur un onglet séparé)

Archivage

Archivage Lames jusqu’au rendu de l’examen

(vérifications parents) Données informatique

Image brute Fichier extrait ? Fiches techniques ? Nombreux Go Durée 30 ans … En double …

Le compte rendu

Généralités Le rapport devrait comporter la

description des seuils et des critères choisis pour différencier le normal de l’anormal.

Le résultat : « spécificité » • Type de plateforme utilisée • L'identification et la nature de la puce, du fournisseur, N° de lot • Le degré de résolution global estimé • Algorithmes de normalisation et de segmentation utilisés, avec les

paramètres si ceux-ci sont différents des paramètres par défaut. • Logiciel de lecture utilisé • Le nombre total de sondes déviantes au niveau de l’anomalie (fonction

du type de puce utilisées, plutôt pour les puces BACs/PACs) • Le type et le nombre de sondes ou loci sur la lame • La résolution attendue (moyenne: taille minimum et maximum) • L’ADN de référence (optionnel) • La Taille du déséquilibre (version genome browser) • Les sondes non déviantes flanquantes (option) • Les sondes déviantes flanquantes (option). Au minimum donner les positions

génomiques • La référence de la carte génomique utilisée au moment du rendu • La représentation graphique des régions remaniées (optionnelle)

Commentaires et conclusion Résultat normal : « Il n'a pas été décelé

d'anomalie génomique déséquilibrée dans les conditions de l'examen » est préférable au terme de « examen normal ».

- Résultat anormal : donner la formule ISCN 2009, préciser les clones ou sondes impliqués, les résultats de la validation FISH/QPCR, ajouter le résultat des parents,

Commentaires / CNP A noter la présence de plusieurs variations du

nombre de copies (CNV) présentes chez des individus normaux, répertoriées dans la base de Toronto et considérées comme non délétères à ce jour.

En fonction de l'évolution des connaissances, ces données pourraient être réinterprétées et nous serions alors amenés à vous recontacter." afin de rechercher ces variations sur les ADNs parentaux pour préciser la corrélation génotype/phénotype

Mentionner les limites ? la puce a été conçue pour diagnostiquer des gains ou

pertes de nombre de copies (déséquilibres chromosomiques).

Elle peut détecter des aneuploidies, pertes, et gains des loci représentés sur la puce.

Elle ne peut pas détecter des anomalies équilibrées (translocations réciproques, translocation robersoniennes, inversions et insertions équilibrées), des mutations ponctuelles, ni des déséquilibres de régions non représentées sur la puce.

Elle ne peut pas détecter des degrés très faible de mosaïcisme (< 20 %).

Exemple : partie technique Plateforme utilisée : Type de puce utilisée : Plan de l’expérience Paramètre qualité ? Ex : valeur du DLRS Niveau de résolution

Exemple : partie interprétation Pas d’anomalie : Pas de déséquilibres

chromosomiques pathogènes mis en évidence Pour les anomalies Présence d’un gain/perte sur tel

chromosome de x mégabase allant de la position génomique y à z comprenant w gènes.

Préciser la version du génome utiliser Si mosaïque, estimer le pourcentage en fonction des

moyennes des valeurs des log2ratio Donner des références bibliographiques si

possible en faveur du caractère pathogène du déséquilibre. Possibilité de faire un courrier à part

Préciser par quelle technique le CNV a été vérifié. Préciser qu’il est recommandé d’étudier les parents Faire référence au conseil génétique

Les vérifications

Les vérifications Technique au choix du laboratoire Recommandation par rapport

Taille Contenu (gène) Exemple : duplication de moins de 300 kb

sans gène : non nécessaire de les vérifier ?

Les vérifications : Parents Préférable de vérifier les CNVs

pathogènes chez les parents Problème de la disponibilité des

prélèvements. Connaître le phénotype des parents

Questions ?

Mise en place d’un CQE

CQE Accréditation

CEQA/EMQN : 1° CQE test

Démarche CQE débuté au niveau de l’ACLF

En pratique Proposer un CQE CGH array prospectif Pilotage : M. Doco et D. Sanlaville Interface : Médifirst Extraction d’un ADN avec le kit midi kit Possibilité de fournir de l’ADN pour 20

laboratoires ADN nouvellement extrait de nouveau

testé sur une puce Agilent

En pratique 2 Appel à candidature en septembre

octobre 2010 20 laboratoires (année test) Appel à candidature de 4 experts

2 experts pour 10 laboratoires + 2 superviseurs (D. Sanlaville, M. Doco)

En pratique 3 Envoi après la phase d’inscription de 4 µg d’ADN anonymisé.

Accord du patient et des représentants légaux pour l’utilisation de l’ADN de façon anonyme.

Réalisation de la CGH array Soumission via l’interface Médifirst du

compte rendu anonymisé

En pratique 4 Phase d’expertise Basé sur le CEQA et le guide des

bonnes pratiques