Post on 25-Jun-2022
Module de BIO 121
Cours de biochimie des acides nucléiques
(Enseignante : Eve de Rosny)
I - Introduction = présentation rapideLes acides nucléiquesRôle de l’ADN et de l’ARNLes nucléotides
II – Structure chimique des acides nucléiquesLes différentes bases azotéesNucléosides et nucléotidesNomenclature
III - Chaines d’ADN et d’ARNStructure primaireConventions d’écriture
IV - Structure tridimensionnelle (structures secondaires et tertiaires)ADN (la double hélice, compaction)ARN (transfert, ribosomiques et messagers)
V - Propriétés physico-chimiques de l’ADNAbsorbanceStabilité (dénaturation)
VI - Méthodes d’étude de l’ADNManipulation de l’ADN (plasmides et enzymes de restriction)Principales techniques d’analyse (électrophorèse)Applications pour la police scientifiques
Cours 1
Cours 2
Cours 3
Plan
N
N
H
HH
HN
N1
2
34
Formule développée Formule semi-développée
simplifiée (sans les H)
N
N
H
HH
HC
CCC
Formule semi-développée
5
6
Pyrimidine
N
NO
NH2
12
34
H
5
6
H
HN
NO
O
12
3 45
6
Cytosine (C) Thymine (T) Uracile (U)
ADN et ARN ADN ARN
CH3HN
NO
O
12
3 4
H
5
6
Purine
N
N
N
NH
H
H
H
1
23
4
56 7
8
9
N
N
N
N
NH2
H
1
23
4
56 7
8
9
HN
N
N
NH2N
O
H
1
23
4
56 7
9
Adénine (A) Guanine (G)ADN et ARN ADN et ARN
Formule semi-développée
O
OHOH
OHCH2OH
H H1’
2’3’
4’
5’O
HOH
OHCH2OH
H H1’
2’3’
4’
5’C
C
C
C
C
OH
OH
OH
OH
OH
H
H
H
H
H
1’
2’
3’
4’
5’
D-Ribose β-D-Ribose β-D-2’ désoxyribose
Le pentose
N
N
N
N
NH2
H
1
23
4
56 7
8
9
O
OH
OHHOH2C
H1’
OH
N
N
N
N
NH2
1
23
4
56 7
8
9
O
OH
HOH2C
H1’
OH
Le pentose : liaison N-osidique
Nucléoside(adénosine)
HO P
O
OH
OH
pKa = 2,1
pKa = 7,2
pKa = 11,9
L’acide phosphorique
Forme majoritaire àA pH physiologique 7,4
R’ OH+-O P
O
O-
OH
O-O P
O-
O R’ H2O+
Fonction ester phosphorique
Fonction ester phosphorique
O
OH
BaseCH2
H
5’
H
O+-O P
O
O-
OHH -O P
O
O-
H2O+OO
OH
BaseCH2
H
5’
H
Nucléoside mono-phosphate
Nucléoside di-phosphate (liaison anhydre d’acide)
H2O+O
OH
CH2
H1’
H
HN
NO
O
1
-O P
O
O-
Oα
-O P
O
O-
OH +O
OH
CH2
H1’
H
HN
NO
O
1
P
O
O-
Oα
-O P
O
O-
Oβ
Desoxythymidine5’ diphosphate
Desoxythymidine5’ monophosphate
5’5’
CH3 CH3
Nucléoside tri-phosphate (liaison anhydre d’acide)
O
OH
CH2
H1’
H
HN
NO
O
1
P
O
O-
Oα
-O P
O
O-
Oβ
-O P
O
O-
OH +
O
OH
CH2
H1’
H
HN
NO
O
1
P
O
O-
Oα
O P
O
O-
Oβ
-O P
O
O-
γ
Désoxythymidine5’ diphosphate
Désoxythymidine5’ triphosphate
H2O+
5’
5’
CH3
CH3
O
-O P
O-
O R’
O
-O P
O
O R’
R
Fonction diester phosphorique
ouPhosphodiester
OCH2
H1’
HN
NO
O
1
-O P
O
O-
Oα 5’
3’
O
αPO
O-
N
N
N
N
NH2
9
O
OH
CH2
H1’
O5’
3’
Extrémité 3’
Extrémité 5’
Liaison 3’-5’phosphodiester
CH3(T)
(A)
H
H
Fonction ester phosphorique
Dinucléotide
OCH2
1’
HN
NO
O
1
-O P
O
O-
Oα 5’
3’
O
αPO
O-
N
N
N
N
NH2
9
OCH2
1’
O5’
3’
Extrémité 3’
Extrémité 5’
Liaison 3’-5’phosphodiester
αPO
O-
HN
N
N
NNH2 9
O
OH
CH2
H1’
O5’
3’
O
O
(T)CH3
(A)
(G)
H
H
H
Trinucléotide
Quizz
O
OHOH
OHCH2OH
H H1’
2’3’
4’
5’
Cette molécule est :A - du ribose B - du désoxyriboseC – du glucose
I
Il s’agit d’une base :A - purique B - pyrimidiqueC – azotée
II N
N
N
N
NH2
H
1
23
4
56 7
8
9
Le carbone C6 est porté parA – la base azotéeB – le riboseC – le phosphate
IV
O
OH
CH2
HH
HN
NO
O
P
O
O-
OP
O
O-
OO P
O
O-
OO P
O
O-
O-O P
O
O-
CH3CH3
1 2 34
Redonnez à chaque liaison numérotée son nom :
A – ester phosphoriqueB – N-osidiqueC – anhydre d’acide
Un nucléoside est formé deA – une base azotéeB – une base azotée + un riboseC – une base azotée + un ribose + un phosphateD – une base azotée + un ribose + deux phosphates
III
V
Découverte de la double hélice par Watson et Crick
N
NN
N
N HH
O
HH
NN
N
O
H
δ- δ+
δ-
δ-
δ+
δ+
C1’(désoxyribose) C1’
(désoxyribose)
1
9
6 4
13
23
Liaisons hydrogènes entre les bases (paires de bases)
δ+
δ-
C1’(désoxyribose)
3HN
N
O
O
δ-
δ+
1
C1’(désoxyribose)
N
H
HN
N
N
N
1
6
2
9
4 CH3
OCH2
-O P
O
O-
O
O
PO
O-O
CH2O
Extrémité 3’
PO
O-O
OH
CH2O
O
C G
A T
O-
OH
HH2C
OO O
O
OO O
O
OO
O
O-
O-
O-
H2C
H2C P
P
P
H
H
HT A
Extrémité 3’
Extrémité 5’
Extrémité 5’
H
H
H
H
H
H
Antiparallélisme
3’
3’
3’
3’
3’
3’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
La double hélice en chiffres
Un tour :
10 paires de bases
3,4 nm
2 nm
Angle entre deux paires de bases
Hélice B
Hélice droite
C1’(désoxyribose)
HN
N
O
O C1’(désoxyribose)
N
H
HN
N
N
N CH3
Petit sillon
Grand sillon
Petit et grand sillon
Cellule eucaryote en interphase
Cellule eucaryote en phase de mitose
Condensation de l’ADN dans le noyau des cellules eucaryotes
Longueur totale de l’ADN chromosomique : ≈1,8 m , taille du noyau ≈10 µm
Condensation de l’ADN dans les bactéries
L’ADN a été artificiellement épaissi pour être visibleLongueur d’un ADN bactérien : ≈1,6 mm, longueur d’une bactérie ≈2 µm
ADN génomique(le plus souvent circulaire)
Plasmide1 à 400 kb
Structure d’un ribosome bactérienOrange : ARNrBleu : protéines de la petite sous unitéVert : protéines de grande sous unitéRouge : antibiotique lié au ribosome
Structure des ARN
ARN de transfert
ARNm(eucaryote)
Coiffe en 5’
5’
PolyA en 3’
Structure secondaireStructure
tertiaire
Synthèse des protéines
ARNm
ARNt
Ribosome
Quizz
Quel est le nombre de liaisons hydrogènes entre une guanine et une cytosineA - 1B - 2C – 3
I
II
IV
Parmi ces types de liaisons indiquez celles qui sont dîtes « faibles ».Quelles sont celles qui stabilisent la double hélice d’ADN ?A – liaison hydrogèneB – liaison covalenteC – interactions hydrophobes
III
VQuel atome se situe à l’extrémité 5’ d’un ADNA – CarboneB – OxygèneC – AzoteD – Hydrogène Que montre la flèche :
A – le grand sillonB – le petit sillon
Les protéines qui reconnaissent l’ADN se fixent :A – dans le grand sillonB – dans le petit sillon
Quelle est la molécule représentée ?:A – ADNB – ARN messagerC – ARN ribosomiqueD – ARN de transfert
Spectre d’absorbance de l’ADN
Stabilité de l’ADN
Suivi de la dénaturation de l’ADN
Dénaturation de l’ADN
Site de restriction 1
Site de restriction 2
Site de restriction 3
PlasmideADN bactérien extra-chromosomique
Lyse bactérie+
Purification des plasmide
+
Etape 1 (extraction des plasmide à partir de bactéries)
Etape 2 (entrée du plasmide dans une autre bactérie)
Etape 3 (amplification du plasmide = multiplication de la bactérie)
Etc….
Amplification d’un plasmide
Exemple de carte de restrictionPosition relative des sites de restriction sur un plasmide
Digestion enzymatique d'un vecteur et d'un insert par EcoRI
Insertion de l’insert dans le plasmide
Electrophorèse
Lumière blanche Lumière UV
Echelle de poids moléculaire
Bromure d’ethidium
-
+
Séparation de l’ADN en fonction de la taille (unité = paires de bases ou pb)
surenroulement
Electrophorèse avec un plasmide
Etc..
Gel d’agarose Membrane de nitrocellulose
+
Coupures par enzymes de restriction
Southern Blot
radioactif
Individu 1 (hétérozygote)
Individu 2 (homozygote)
Individu 3 (hétérozygote)
Séquences courtes en tandem
Polymorphisme de longueur
Chromosome 1Chromosome 2
Chromosome 1Chromosome 2
Chromosome 1Chromosome 2
Preuve par l’ADNRaphaël Coquoz
CTGG CTGG CTGG CTGG CTGG
Détection du polymorphisme de longueur de fragments de restriction (par Southern Blot)
1 - Digestion des ADN par des enzymes de restriction
2 – migration sur un gel l’électrophorèse
3 – Southern blot incubation avec un fragment d’ADN radioactif complémentaire des séquences répétées (GACCGACC)
Exemple réel d’un cas de viol
Qui est l’agresseurs ?
Méthode utilisée aujourd’hui (PCR)
1 – Amplification des séquences répétées
2 – migration sur un gel d’électrophorèse
3 – coloration du gel par du bromure d’éthidium. Ne vont être visibles que les fragments amplifiés.
Exemple réel
Le suspect est-il coupable ?
Exemples de marqueurs utilisés par le FBI
Quizz
L’ADN et l’ARN absorbent fortement la lumières à :A – 280 nm ?B – 260 nm ?C – 400 nm ?
I
II
IV
Parmi ces séquences laquelle est susceptible d’être reconnues par une enzymes de restriction ?
A – TCGATTAGCTAA
B – AAGCTTTTCGAA
III
VQuelle séquence a la température de dénaturation (Tm) la plus élevée ?
A – CACGATGAGTGCTACT
B – TGACTAGCACTGATCG
L’électrophorèse sépare l’ADN en fonctionA – de la chargeB – de la tailleC – de la séquence
Est-il le père ?