Biologie du développement animal

!icence de Science" et #chnologie"$en%on Sciences de la Vi&

Comment passe-t-on d'une cellule oeuf à un individu composéde cent mille milliards de cellules ?

??

Par une organisation hiérarchique des systèmes,par des processus de développement qui reposent surdes activités cellulaires coordonnées dans l’espace et le temps

I) Rappels

TranscriptionTraduction

Assemblage en structuressupramoléculaires

Organisation spatialeet fonctionnelle Rétrocontrôle

Rétrocontrôle

Rétrocontrôle

L’organisation hiérarchique des systèmes biologiques Les systèmes biologiques sont gérés par des modules fonctionnels decomplexité croissante et interdépendants

D’après Arias et Stewart, 2003

I) Rappels

Systèmes de signalisation,

Systèmes de régulation

Comportements cellulairesDivisionMigrationAdhérenceProlifération…

I) Rappels Les interactions entre les modules contribuent à construire l’organisme

D’après Arias et Stewart, 2002

I) Rappels

Les processus de développement reposent sur des activités cellulaires communes

proliférationscommunicationsdivisions asymétriqueschangements de formesdéplacement des cellules ou des tissusregroupement de cellules ou de tissusdifférenciationapoptose

Et une coordination dans l’espace et le tempsactivité nucléaire, gènes du développementséquence continueplan d’organisation commun

Nombre de chromosomes 40Quantité d’ADN/cellule 6pg (3.109 pb) Nombre de gènes 30.103

Temps de gestation 19 - 20 joursAge au sevrage 3 semainesMaturité sexuelle 6 semainesMoyenne des portées 6 - 8 souriceaux Nombre de portées/femelle 4 à 8Durée de vie au laboratoire 1,5 - 2,5 années

Le cycle de développement

Chapitre 1 : La gamétogenèse

I) Les spermatozoïdesII) Production des gamêtes femelles : vue d’ensembleIII) Croissance ovocytaire et folliculogenèse

a) l’évolution des folliculesb) la croissance de l’ovocytec) la zone pellucided) maturation et ovulation engendrent la cellule fécondable.

IV) La cellule fécondable est polarisée

(A) Spermatozoïde de souris (d’après Retzius). (B) Spermatozoïde humain (D’après Czyba, 1975)

I) Les spermatozoïdes

II) Production des gamêtes femelles : vue d’ensemble

MéioseOvogenèse

Folliculogenèse

Maturation

Ovulation

III) Croissance ovocytaire et folliculogenèsea) l’évolution des follicules

III) Croissance ovocytaire et folliculogenèsea) l’évolution des follicules

Follicule tertiairecavitaire

Cellules folliculaires, corona radiata

ZP

Jonctions gap

III) Croissance ovocytaire et folliculogenèsea) l’évolution des follicules

La zone pellucide

c) la zone pellucide

d) maturation et ovulation engendrent la cellule fécondable.

d) maturation et ovulation engendrent la cellule fécondable.

d) maturation et ovulation engendrent la cellule fécondable.

Polarité structurale

IV) La cellule fécondable est polarisée

IV) La cellule fécondable est polarisée

Quelques caractéristiques de la cellule fécondable

Diamètre 85 m

Volume 270 pl

Volume du pronucleus 1 pl

Quantité de protéines 23 ng

Quantité d'ADN total 8 pg

Quantité d'ADN génomique 5-6 pg

Quantité d'ADN mitochondrial 2-3 pg

Nombre de mitochondries 105

Quantité d'ARN ribosomique 0,2-0,4 ng

Quantité d'ARN messager non déterminé

Quantité d'ARN de transfert 0,14 ng

Bilan

• La cellule fécondable est un ovocyte II.

• Cet ovule est alécithe.

• La méiose est bloquée en métaphase de seconde division.

• L ’ ovocyte II est entouré par des cellules somatiques qui

forment la corona radiata

• Le premier globule polaire est expulsé à un des pôles de la cellule.

• O n distingue une polarité structurale pour cette cellule.

• O n peut définir un axe passant par le globule polaire, le fuseau

méiotique et le centre de la cellule.

• U ne symétrie radiaire.

La Fécondation

une conversation entre deux cellulesradicalement différentes

Chapitre 2

1. La capacitation rend le spermatozoïde fécondant

2. Des enzymes, des molécules adhésives et signalisatrices participent à la fécondationa) La protéine ZP3 et ses récepteurs assurent l'adhérence du spermatozoïdeà la ZP.b) La réaction acrosomique résulte d'une signalisation.c) La pénétration dans la zone pellucide implique des protéases.d) L’adhérence à la membrane de l’ovocyte requiert des molécules adhésives.e) La fusion des membranes plasmiques impliquerait les fertilines.

3. Les réactions d’activation.a) les oscillations calciquesb) l’exocytose du contenu des granules corticaux.c) les autres réactions d’activation.

4. Au plan du développement, les pronuclei ne sont pas équivalents.

5. L’assistance médicale à la procréation.a) L’insémination artificielleb) La fécondation in vitroc) L’injection intra-cytoplasmique d’un spermatozoïde

Chapitre 2 La fécondationUn conversation moléculaire entre deux cellules radicalement différentes

1. La capacitation rend le spermatozoïde fécondant

Modifié d’après Alberts, 1995

2. Des enzymes, des molécules adhésiveset signalisatrices participent à la fécondation

a) La protéine ZP3 et ses récepteurs assurent l'adhérence du spermatozoïde à la ZP.

2. Des enzymes, des molécules adhésiveset signalisatrices participent à la fécondation

b) La réaction acrosomique résulte d’une signalisation

L ’interaction avec la ZP3 déclenche l ’exocytose du contenu de l ’acrosome

fusion ponctuelle des membranesvésicularisation antéro-postérieurelibération des enzymes

b) La réaction acrosomiquerésulte d’une signalisation

c) La pénétration dans la zone pellucide implique des protéases

Hyaluronidase : détruit l ’acide hyaluroniquequi occupe les mailles de la ZP

β-N-acétylglucosamine : hydrolyse la ZP2, fragilise la ZP

L ’acrosine : sérine protéase, rompt les pontages entre la ZP1 et la ZP2-ZP3 Inactivation génique n ’affecte pas la fertilité. Rôle facilitant mais pas déterminant.

d) L’adhérence à la membrane de l’ovocyte requiert des molécules adhésives.

Anti α6

Contrôle

Transfections

d) L’adhérence à la membrane de l’ovocyte requiert des molécules adhésives.

Les intégrines

Cellules transfectées

P

D

CE

M

Cy

P

D

CE

M

Cy

P

D

C

M

P

D

C

M

SVMPsSVMPsADAMADAM

Dégradation dela lame basale

Inhibition del’agrégation

des plaquettes(αΙΙbβ3, fibrinogène)

ADAM :ADAM :AA DDisintegrin isintegrin AAnd nd MMetalloproteaseetalloprotease

Classe P-III

Domaine désintégrine

Peptide de fusion

RGD, arg-gly-serECD, glu-cys-ser

d) L’adhérence à la membrane de l’ovocyte requiert des molécules adhésives.

P

D

CE

M

Cy

P

D

CE

M

Cy

Fertilines Fertilines immaturesimmatures

αADAM 1

βADAM 2

Clivage(spermatozoïdes)

c

D

CE

D

CE

D

CE

D

CE

α β

FertilinesFertilines

Maturation dans le testicule etle transit dans épididyme

??

13 spécifiques du testiculeMaturation : ADAM 1, 2, 3, 5 et 18

d) L’adhérence à la membrane de l’ovocyte requiert des molécules adhésives.

+ extrait membranes de extrait de spermatozoïdes cellule contrôle

Billes-IgG anti-NH2 fertiline β

d) L’adhérence à la membrane de l’ovocyte requiert des molécules adhésives.

billes

d) L’adhérence à la membrane de l’ovocyte requiert des molécules adhésives.

Billes-IgG anti-NH2 fertiline β+ extrait spermatozoïdes

Témoin peptide (14 aa) peptide témoin anti α6 non immun

Billes D + C

β peptide (14 aa) β peptide muté

Anti α6 Contrôle

D

C

d) L’adhérence à la membrane de l’ovocyte requiert des molécules adhésives.

Anti α6

Conclusions : 1 - interaction dépend de la fertiline β 2 - implique la boucle désintégrine 3 - implique la sous-unité α6 des intégrines

d) L’adhérence à la membrane de l’ovocyte requiert des molécules adhésives.

e) La fusion des membranes

!

!

Spermatozoïde

Fertiline

Ovocyte

Intégrines ("6!1)

"

"6!

!1

Fusion potentielle ?

Protéines de liaison

Protéines de signalisation

Activation de l'oeuf ?

Un modèle possible

e) La fusion des membranes

1. La capacitation rend le spermatozoïde fécondant

2. Des enzymes, des molécules adhésives et signalisatrices participent à la fécondationa) La protéine ZP3 et ses récepteurs assurent l'adhérence du spermatozoïde àla ZP.b) La réaction acrosomique résulte d'une signalisation.c) La pénétration dans la zone pellucide implique des protéases.d) L’adhérence à la membrane de l’ovocyte requiert des molécules adhésives.e) La fusion des membranes plasmiques impliquerait les fertilines.

3. Les réactions d’activation.a) les oscillations calciquesb) l’exocytose du contenu des granules corticaux.c) les autres réactions d’activation.

4. Au plan du développement, les pronuclei ne sont pas équivalents.

5. L’assistance médicale à la procréation.a) L’insémination artificielleb) La fécondation in vitroc) L’injection intra-cytoplasmique d’un spermatozoïde

Chapitre 2 La fécondationUn conversation moléculaire entre deux cellules radicalement différentes

Les mécanismes possibles de l’activation de l’œuf par le spermatozoïde.

3. Les réactions d’activation.a) les oscillations calciques

b) l’exocytose du contenu des granules corticaux.

Les granules corticaux contiennent l’enzyme N-acétyl-glucosaminidase.Hydrolyse de la partie glucidique de la ZP3Barrière à la polyspermie

c) les autres réactions d’activation :l’achèvement de la méiose, la formation des pronucléi, la réplication

Ovocyte mature non fécondé 5 h après la fusion

2° globule polaire

Pronucléus

microtubules

Rassemblement des pronucléi 16 h après la fusion

Fuseau mitotique

métaphase

Micrographied’un œuf humain

ImmunofluorescenceAnti-tubulineColorant de l’ADN

D’après Simerly C et coll., (1995) Nat. Med 1, 47-53.

c) les autres réactions d’activation :l’achèvement de la méiose, la formation des pronucléi, la réplication

(Modifié d’après Alberts, 1994)

c) les autres réactions d’activation :l’achèvement de la méiose, la formation des pronucléi, la réplication

Bilan

La fécondation s’initie lorsque la tête d’un spermatozoïdeayant subi la capacitation entre en contact avec la zonepellucide de l’ovocyte II.

L’interaction spécifique qui s’établit alors provoque dansla tête du spermatozoïde la mise en route d’une voie designalisation intracellulaire qui déclenche la réactionacrosomique.

Les enzymes libérées et le mouvement propre au flagellelui permettent de traverser la zone pellucide.

Au niveau de la membrane plasmique de l’ovocyte, une seconde interactionspécifique permet l’adhérence du spermatozoïde sur l’ovocyte et la fusiondes deux cellules.

Il en résulte l’activation de voie(s) de signalisation intra-ovocytaire(s)conduisant à :

– la libération du contenu des granules corticaux,– la formation des pronuclei,– la synthèse d’ADN préparant la première division de l’œuf,– à l’initiation du développement.

La fécondation a donc pour conséquences essentielles de reconstituerl’assortiment diploïde des chromosomes caractéristique de l’espèce,d’établir le sexe chromosomique du nouvel individu, de transmettre descaractères héréditaires maternels et paternels.

Bilan

Au total, la fécondation est le fruit d'une conversation qui se réaliseentre deux cellules radicalement différentes. Ce dialogue subtil estengendré par un langage sucré et un langage protéique.

La conversation entre le spermatozoïde et la zone pellucideimplique le langage sucré. Les groupements glycosylés de la zonepellucide de part leur nature, leur configuration spatiale et leurquantité offre des possibilités multiples de dialogue avec la membraneplasmique du spermatozoïde. Au cours de l'évolution, ils ont étésélectionnés pour contribuer à la spécificité de reconnaissance entre lespermatozoïde et la zone pellucide contribuant ainsi à la limitation desfécondations entre les espèces.

La conversation entre la membrane plasmique duspermatozoïde et celle de l'ovocyte requiert le langage protéique. Saprécision n'est plus totalement nécessaire puisque les barrièresd'espèces ont été réalisées par le langage sucré. Le langage protéiquefait intervenir des protéines d'adhérence et fusogéniquestransmembranaires. Elles sont également utilisées dans d'autresmécanismes de reconnaissance et de fusion cellulaire.

Bilan

Bilan

Chronologie des événements survenant après fécondation

in vitro

Événements Heures après

l'insémination

Émission du second globule polaire 2 à 5

Formation du pronucleus mâle 4 à 7

Formation du pronucleus femelle 6 à 9

Réplication de l'ADN 11 à 18

Division 17 à 20

1. La capacitation rend le spermatozoïde fécondant

2. Des enzymes, des molécules adhésives et signalisatrices participent à la fécondationa) La protéine ZP3 et ses récepteurs assurent l'adhérence du spermatozoïde àla ZP.b) La réaction acrosomique résulte d'une signalisation.c) La pénétration dans la zone pellucide implique des protéases.d) L’adhérence à la membrane de l’ovocyte requiert des molécules adhésives.e) La fusion des membranes plasmiques impliquerait les fertilines.

3. Les réactions d’activation.a) les oscillations calciquesb) l’exocytose du contenu des granules corticaux.c) les autres réactions d’activation.

4. Au plan du développement, les pronuclei ne sont pas équivalents.

5. L’assistance médicale à la procréation.a) L’insémination artificielleb) La fécondation in vitroc) L’injection intra-cytoplasmique d’un spermatozoïde

Chapitre 2 La fécondationUn conversation moléculaire entre deux cellules radicalement différentes

Croisement interspécifique Cheval / Ane

Le cheval et l'âne appartiennent à deux espèces différentes mais suffisament proches pour pouvoir être croisées. Les hybrides sont habituellement stériles. Le croisement d'un âne avec une jument donne un mulet le croisement inverse (un cheval avec une anesse) donne un bardot. Ces deux hybrides ont un phénotype différent alors qu'ils sont tous les deux porteurs d'un hémi génome de cheval et d'un hémi génome d'âne. D’après la génétique mendelienne, ces deux animaux sont porteurs de la même information génétique et devraient présenter un phénotype identique. Pourquoi sont-ils différents ?? Existence d'un mécanisme régulateur qui modifie l'expression de certains gènes selon qu'ils sont transmis par le mâle ou la femelle : c'est l 'empreinte parentale .

4. Au plan du développement, les pronuclei ne sont pas équivalents.

La môle hydatiforme est une anomalie rare de la grossesse, définie par la proliferation kystiquedes villosités choriales associée à une dégénérescence tumorale du trophoblaste. Il n'y a pasd'embryon, et donc pas de grossesse vraie.Le risque majeur de cette pathologie est la constitution d'un choriocarcinome, tumeur maligne demauvais pronostic. (1 pour 2 à 3000 accouchements en Europe)

soit par fécondation dispermiquedeux spermatozoïdes fécondent un ovocyte dépourvu de noyaules deux pronucléus mâles fusionnent alors pour constituer unnoyau diploïde.

Les analyses des cellules des môles montrent un caryotype diploïde, tous les chromosomes proviennent du père.

soit fécondation monospermiqueun seul spermatozoïde pénètre dans un ovuleoù il manque le pronucléus femelle et subit une mitose initialenon suivie de segmentation créant ainsi un noyau diploïde .

4. Au plan du développement, les pronuclei ne sont pas équivalents.

Données naturelles

Noyau mâle

gynogénote

Pipet

Après fécondation

Injection noyau femelle

Deux pronuclei femelles: arrêt du développement à 10 jours

4. Au plan du développement, les pronuclei ne sont pas équivalents.

Données expérimentales

Aspiration du noyau femelle

Injection d’un noyau mâle

androgénote

Deux pronuclei mâles: arrêt du développement à 11 jours

4. Au plan du développement, les pronuclei ne sont pas équivalents.

Données expérimentales

Empreinte parentale chez la souris

4. Au plan du développement, les pronuclei ne sont pas équivalents.

4. Au plan du développement, les pronuclei ne sont pas équivalents.

4. Au plan du développement, les pronuclei ne sont pas équivalents.

Cas de l’IGF et de son récepteur

Gynogénote ??

Androgénote ??

4. Au plan du développement, les pronuclei ne sont pas équivalents.

4. Au plan du développement, les pronuclei ne sont pas équivalents.

En résumé

L'empreinte parentale est un mécanisme de régulation épigénétique qui entraîne une expression différentielle de certains gènes en fonction du parent transmetteur. Elle repose sur sur des modifications épigénétiques de l’ADN, caractérisées par :

une absence d’altération de la séquence des gènes ou des séquences régulatrices une réversibilité à chaque génération

Ces deux critères permettent d'opposer les modifications épigénétiques aux mutations (= modifications génétiques) qui elles, sont stables de génération en génération.

Cette expression parent spécifique est sous tendue par une méthylationdifférentielle au niveau de loci qui peuvent être dans le gène ou à distance du gène.

La méthylation contrôle l'expression par son rôle dans la compaction de la chromatine,empêchant l'accès des protéines du complexe de transcription à leur site de liaisonsur l'ADN.

L'empreinte parentale n'agit que sur un petit nombre de gènes éventuellementmême uniquement dans certains tissus et/ou à certains stades du développement.

4. Au plan du développement, les pronuclei ne sont pas équivalents.

1. La capacitation rend le spermatozoïde fécondant

2. Des enzymes, des molécules adhésives et signalisatrices participent à la fécondationa) La protéine ZP3 et ses récepteurs assurent l'adhérence du spermatozoïde àla ZP.b) La réaction acrosomique résulte d'une signalisation.c) La pénétration dans la zone pellucide implique des protéases.d) L’adhérence à la membrane de l’ovocyte requiert des molécules adhésives.e) La fusion des membranes plasmiques impliquerait les fertilines.

3. Les réactions d’activation.a) les oscillations calciquesb) l’exocytose du contenu des granules corticaux.c) les autres réactions d’activation.

4. Au plan du développement, les pronuclei ne sont pas équivalents.

5. L’assistance médicale à la procréation.a) L’insémination artificielleb) La fécondation in vitroc) L’injection intra-cytoplasmique d’un spermatozoïde

Chapitre 2 La fécondationUn conversation moléculaire entre deux cellules radicalement différentes

5. L’assistance médicale à la procréation.

AMP : - Inséminations Intra-Utérines - Fécondation in vitro SANS micromanipulation - Fécondation in vitro AVEC micromanipulation

En juillet 1978 est née par césarienne à l'hopital d'Oldham,en Grande-Bretagne, Louise Brown, le premier bébé éprouvette.Mariée en Septembre 2004. Elle a accouché d'un bébéqui a été conçu naturellement et qui est né le 13 janvier 2007.

Octobre 1978 : en Inde à Calcutta, Durda

1981 : Elisabeth, première FIV aux USA

1982 : Amandine, première FIV en France

1984 : Zoé

2006 : 100 000 bébés éprouvettes

5. L’assistance médicale à la procréation.

a) L’insémination artificielle

Follicules

Stimulation de l’ovulation

Différents protocoles : injections quotidiennes FSH

Surveillance sous échographie : mesurer et compter les follicules. Endomètre utérin

Déclanchement de l’ovulation par injection d’HCG

Entre l’injection et l’ovulation,36h sont nécessaires à la maturationfinale de l’ovocyte.

Dr. Catherine Poirot CHUPS

5. L’assistance médicale à la procréation.a) L’insémination artificielle

Recueil du sperme, jour de l’insémination, donneur ou conjoint

Ils proviennent :de sperme éjaculéde l’épididyme (ponction épididymaire) du testicule (biopsie testiculaire).de spermatozoïdes congelés (une perte de la mobilité d’environ 50 %)

Le but de la préparation du sperme est d’éliminer le plasma séminal etde sélectionner les spermatozoïdes mobiles et morphologiquement normaux.

Centrifugation des spermatozoïdes au travers d’un gradient de densité.

Les spermatozoïdes morts, anormaux, ainsi que les contaminantscellulaires s’accumulent dans les fractions de densité faible, alors queles spermatozoïdes mobiles et normaux traversent le gradient.Ils se retrouvent dans le fond (culot) du tube.

Les spermatozoïdes ainsi isolés sont lavés avec du milieu de culture.

Injection dans l’utérus, cathéter

Taux de grossesse 10% - 15% par cycle

Grossesses normales, gémellaires dans 15% des cas, triple dans 3%.

Indications :

• Hypofertilité d’origine cervicale– Pas de glaire– Glaire inadéquate– Anticorps anti-spermatozoïdes dans la glaire

5. L’assistance médicale à la procréation.a) L’insémination artificielle

5. L’assistance médicale à la procréation.b) La fécondation in vitro

Stimulation de l’ovulationDifférents protocoles : injections quotidiennes FSHSurveillance sous échographie : mesurer et compter les follicules. Endomètre utérinDéclanchement de l’ovulation par injection d’HCG

Avant l’ovulation, le contenudes follicules est ponctionné.

Dr. Catherine Poirot CHUPS

Les ovocytes sont recueillis, avec le cumulus.

Le diamètre de l’ovocyte est d’environ 0,1 mm alors que celui du complexe cumulus-oophorus est d’environ 1 mm

5. L’assistance médicale à la procréation.b) La fécondation in vitro

Oocyte englobé dans son cumulusDr. Catherine Poirot CHUPS

Les ovocytes (2 ou 3 dans 0,5 ml de milieu) sont mis en présencedes spermatozoïdes mobiles (50 000-100 000 spermatozoïdesmobiles/ml).

Pendant les heures qui suivent, les spermatozoïdes vont traverserle cumulus et s’attacher à la zone pellucide qui entoure l’ovocyte.

En général, un seul de ces spermatozoïdes parvient à traverser lazone pellucide, atteint la surface de l’ovocyte et pénètre dansl’ovocyte.

La mobilité du spermatozoïde est essentiellepour qu’il parvienne jusqu’à l’ovocyte.

La morphologie du spermatozoïdesemble également importante pourassurer le succès de la fécondation in vitro.

Ovocytes en contact avecdes spermatozoïdes

5. L’assistance médicale à la procréation.b) La fécondation in vitro

5. L’assistance médicale à la procréation.b) La fécondation in vitro

Le contact est maintenu pendant 20h

Le milieu est renouvelé

Les embryons sont sélectionnés sur la base de leur aspect, nombre et régularité des cellules

Le transfert des embryons est entrepris

Un à quatre embryons sont déposés dans l’utérus

Dr. Catherine Poirot CHUPS

5. L’assistance médicale à la procréation.b) La fécondation in vitro

Taux moyen d’embryon par ovocytes recueillis : 60%

Taux de grossesses après transfert : 25%

Dans 20% des cas, ces grossesses sont interrompues spontanément avant le 3°mois

Dans 4% après le 4° mois

Grossesses simples 70%; gémellaires : 30%; triples : 3%

Indications

Stérilités tubairesEndométrioseSpermeEchecs des inséminations

L’ICSI - « intracytoplasmic sperm injection »

Avec cette technique, un spermatozoïde estdirectement injecté dans l’ovocyte à l’aide depipettes en verre très fines. Un microscopeéquipé d’une excellente optique et une pairede micromanipulateurs sont nécessaires.

Technicien procédant à une ICSI

5. L’assistance médicale à la procréation.c) L’injection intra-cytoplasmique d’un spermatozoïde

Préparation des ovocytes

L’ovocyte doit être bien visible pour permettre l’injection du spermatozoïde.Les cellules du cumulus sont éliminées avec de la hyaluronidase.Les cellules de la corona radiata doivent être détachées pour que la ZP et lecytoplasme soit visible.Des mouvements de va-et-vient de l’ovocyte dans une pipette ayant undiamètre légèrement supérieur à l’ovocyte permettent le détachement descellules.Cette procédure s'appelle la décoronisation.

Aspiration de l'ovocyte dans la pipette

Détachement des cellules de la corona radiata

5. L’assistance médicale à la procréation.c) L’injection intra-cytoplasmique d’un spermatozoïde

Détermination de la maturité de l’ovocyte

Seul un ovocyte mature peut être fécondé.

L’ovocyte mature se trouve en métaphase de laseconde division méiotique (métaphase II) etse caractérise par la présence du 1er globulepolaire dans l’espace périvitellin.

L’ovocyte immature se trouve au stadediplotène de la prophase I et présente un grandnoyau : la vésicule germinative.

L’ovocyte en cours de maturation se trouve àun stade intermédiaire de la méiose; il n’a plusde vésicule germinative mais le 1er globulepolaire n’est pas encore apparu.

Les ovocytes immatures représentent unefaible proportion des ovocytes récoltés.Ces ovocytes sont laissés en culture et ne sontinjectés que s’ils parviennent à maturité invitro.

5. L’assistance médicale à la procréation.c) L’injection intra-cytoplasmique d’un spermatozoïde

Sélection du spermatozoïde

Les spermatozoïdes mobiles et normaux sont choisis.La mobilité est importante car elle signale que le spermatozoïde est vivant.Pour ralentir la vitesse de déplacement des spermatozoïdes, on ajoute dupolyvinyilpyrrolidone (PVP, 10%) à la suspension.Sous le microscope, le spermatozoïde sélectionné est immobilisé en comprimantsa queue contre le support avec la pipette d’injection.La queue est coupée puis il est aspiré.L’élimination de la queue du spermatozoïde est nécessaire pour éviter que deslésions soient induites par les mouvements du spermatozoïde dans le cytoplasmeet pour permettre l’activation de l’ovocyte.

5. L’assistance médicale à la procréation.c) L’injection intra-cytoplasmique d’un spermatozoïde

Mise en place de l’ovocyte

L’ovocyte à injecter est placé dans un goutte de milieu (5 µl) recouverte d’huileet maintenu en place avec une pipette de contention («holding pipette»).Le 1er globule polaire est placé à 6h de telle sorte que le fuseau méiotique, surlequel sont disposés les chromosomes maternels et qui est en général prochedu globule polaire, ne se trouve pas sur la trajectoire de la pipette d’injection.

Pénétration de la membrane plasmique (oolemma) et injection duspermatozoïde

Le spermatozoïde estdans la pipette de micro-injection

5. L’assistance médicale à la procréation.c) L’injection intra-cytoplasmique d’un spermatozoïde

La pipette de micro-injection perce la membrane de l'ovocyte

5. L’assistance médicale à la procréation.c) L’injection intra-cytoplasmique d’un spermatozoïde

L’oolemma n’est pas toujours facile à percer avec la pipette d’injection.

Pour faciliter la rupture de l’oolemma, la pipette d’injection contenant lespermatozoïde est enfoncée profondément dans l’ovocyte et un peu du cytoplasmeest immédiatement aspiré jusqu’à ce que la membrane de l’ovocyte se rompe.

La pipette est engagée jusqu'au centre de l'ovocyte

5. L’assistance médicale à la procréation.c) L’injection intra-cytoplasmique d’un spermatozoïde

Le spermatozoïde est introduit dans l'ovocyte

Puis le cytoplasme aspiré est doucement réinjecté dans l’ovocyte etle spermatozoïde déposé dans le cytoplasme avec un minimum de milieu.

5. L’assistance médicale à la procréation.c) L’injection intra-cytoplasmique d’un spermatozoïde

La pipette de micro-injection est retirée laissant une petite cicatrice qui disparaîtra rapidement

La pipette d’injection est délicatement retirée, et l’ovocyte est libéréde la pipette de contention et immédiatement mis en culture.

5. L’assistance médicale à la procréation.c) L’injection intra-cytoplasmique d’un spermatozoïde

Observation de la fécondation (Jour 1)Il est important de déterminer que la fécondation a eu lieu et qu’elle est normale.La fécondation normale se traduit par l’expulsion du 2ème globule polaire dansl’espace périvitellin et la présence de 2 pronuclei dans l’ovocyte.Les pronuclei peuvent apparaître quelques heures après l’ICSI et sont souventencore visibles 20h plus tard.Par commodité, les ovocytes sont généralement observés le lendemain du recueilovocytaire, 14 à 18h après l’injection.

Ovocyte fécondé présentant 2 pronuclei et 2 globules polaires

5. L’assistance médicale à la procréation.c) L’injection intra-cytoplasmique d’un spermatozoïde

Fécondation anormale

La fécondation est anormale lorsque plus de 2 pronuclei sont présents.L’absence d’émission du 2ème globule polaire de l’ovocyte en serait la cause.La présence d’un seul pronucleus est également une situation anormale car ils’agit d’une activation du développement se produisant sans le concours duspermatozoïde. Les ovocytes fécondés anormalement ne sont jamais utiliséspour le traitement.

Ovocyte triploïde (avec 3 pronuclei)

5. L’assistance médicale à la procréation.c) L’injection intra-cytoplasmique d’un spermatozoïde

5. L’assistance médicale à la procréation.c) L’injection intra-cytoplasmique d’un spermatozoïde

Développpement embryonnaire (Jour 2-6)

La disparition des pronuclei indique que l’ovocyte fécondé se prépare à la 1èredivision cellulaire.Les premières divisions sont visibles le lendemain de l’observation despronuclei. En général, 2 à 4 blastomères au jour 2, 4 à 8 blastomères au jour 3et blastocyste aux jours 5 ou 6.

Trois jours

Les embryons sont sélectionnés sur la base de leur aspect, nombre et régularité des cellules

Le transfert des embryons est entrepris (Jour 3)

Un à quatre embryons sont déposés dans l’utérus

5. L’assistance médicale à la procréation.c) L’injection intra-cytoplasmique d’un spermatozoïde

Indications

Hypofertilités masculine

Echecs de fécondation in vitro

Conclusions

Les étapes de la fécondation in vitro conventionnelle et de l’ICSI sontidentiques sauf en ce qui concerne la rencontre du spermatozoïde et del’ovocyte.Dans la FIV, le spermatozoïde parvient lui-même à entrer dans l’ovocyte aprèsavoir traversé les barrières qui l’entourent (le cumulus et la zone pellucide).En ICSI le spermatozoïde est placé directement à l’intérieur du cytoplasme del’ovocyte.

Les étapes principales de la fécondation in vitro, avec ou sans ICSI :

JOUR 0 Recueil des ovocytesPréparation du spermeMise en contact des gamètes : FIV conventionnelle ou ICSI

JOUR 1 Observation de la fécondation, présence de 2 pronuclei, stade: zygoteDéveloppement in vitro de 3 zygotes au maximumCongélation des zygotes surnuméraires

JOUR 2 : observation du développement embryonnaire, stade 2-4 blastomères

JOUR 3 : Transfert d’embryons, stade: embryon 4-8 blastomères

5. L’assistance médicale à la procréation.

Echec des fécondations

En FIV conventionnelle, les spermatozoïdes peuvent présenter uneanomalie (mobilité insuffisante, morphologie altérée, présenced’anticorps, anomalie non définie) qui les empêchent de féconderl’ovocyte.L’immaturité des ovocytes peut aussi être une cause d’échec defécondation.Le manipulateur ???

En ICSI, l’absence d’activation de l’ovocyte, due à une anomalie del’ovocyte ou du spermatozoïde, semble être la cause la plus probablede l’échec Cependant pour un couple donné, un échec de fécondationdans un cycle ICSI ne signifie pas forcément qu’un second échec auralieu lors d’un traitement ultérieur.En ICSI, 60% des ovocytes sont fécondés et 95% de chance d’avoir unembryonTaux de grossesses comparable à la FIVFausses couches 20% = la nature.

5. L’assistance médicale à la procréation.

Les problèmes éthiques liés à la FIV sont nombreux :

* Manipulation de la vie dès son commencement : tentation d'eugénisme * Congélation des embryons : statut juridique et moral de l'embryon.

Devenir de l'embryon congelé. Jumeaux nés à plusieurs années de distance ... * Risque de naissances multiples, donc de prématurité. * Réduction embryonnaire, posant les mêmes problèmes éthiques que l'avortement. * Possibilité pour une femme très âgée de mettre au monde : responsabilité de la vie. * Confusion de la notion de paternité : femme portant l'enfant de sa fille,

donneur de sperme, donneuse d'ovule : Qui est le père ? Qui est la mère ? * Possibilité de trafic d'embryons. * Que faire des embryons non implantés ? * Faut-il tester les embryons à réimplanter dans certains cas?

(famille avec maladie héréditaire, embryon thérapeutique)

1. La capacitation rend le spermatozoïde fécondant

2. Des enzymes, des molécules adhésives et signalisatrices participent à la fécondation

3. Les réactions d’activation.

4. Au plan du développement, les pronuclei ne sont pas équivalents.

5. L’assistance médicale à la procréation.

6. Manipuler l’ovocytea) parthénogenèseb) transgenèse

le spermatozoïde, vecteur possiblel’injection d’un transgène

Chapitre 2 La fécondationUn conversation moléculaire entre deux cellules radicalement différentes

La parthénogenèse correspond au développement d’un organisme à partir du seul gamète femelle et donc sans fécondation. Elle résulte du développement d'un embryon à partir d'un ovocyte dont le génome maternel haploïde s'est dupliqué. Cette duplication aboutit à la constitution d'une cellule diploïde dont le développement devient possible selon les règles de la génétique mendelienne. C'est ce que l'on observe dans la plupart des espèces ou la parthénogenèse est possible. Ce mode de développement se rencontre beaucoup dans l’embranchement des arthropodes En revanche, ce phénomène n'existe pas chez les mammifères, ou plus exactement il ne permet pas le développement d'organismes viables. La parthénogenèse naturelle existe chez certains lézards et dans le cas du dindon. . Chez le dindon, un certain pourcentage d’œufs présente un début de développement parthénogénétique. Beaucoup de ces œufs vont spontanément arrêter leur développement. Toutefois, un petit nombre de ces œufs continue leur développement et donne des individus tous diploïdes. Ce sont tous des mâles. On suppose qu’il y a eu rétention du deuxième globule polaire, ce qui rétablit la diploïdie.

6. Manipuler l’ovocytea) parthénogenèse

6. Manipuler l’ovocyteb) transgenèse

La transgenèse correspond au transfert expérimental d’une séquence d’ADN dans un organisme dans des conditions qui favorisent la transmission de cette nouvelle information génétique à la descendance. Chez la souris cette possibilité Le transfert de l’ADN peut se réaliser à différents moments du développement.

Après la fécondation, la transgenèse peut être réalisée par injection intranucléaire.

En pratique :

6. Manipuler l’ovocyteb) transgenèse

6. Manipuler l’ovocyteb) transgenèse par microinjection

Limites :site(s) d’insertion(s) ?

nombre de transgènes intégrés

intégration dans une séquence régulatrice, dansun gène endogène

intégration en tandems (délétions, duplications)